袁 慧，吴 茜，楚 曼，徐军建，白艳荣

(陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712021)

类风湿性关节炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫性疾病，其发病与机体获得性免疫反应失衡及多种炎症因子大量释放有关[1]。大量研究表明，IL-23/IL-17炎症轴在RA的发病过程中起重要作用，白介素-23(Interleukin-23，IL-23)作用于Th17细胞，刺激其释放白介素-17(Interleukin-17，IL-17)， IL-17 募集并激活中性粒细胞，促使 T 细胞活化，并刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞，促进白细胞介素-6(Interleukin，IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎症因子的分泌，从而诱发局部炎症，且IL-17、TNF-α、IL-6共同参与骨和软骨的降解过程[2-3]。虎威通痹汤系陕西中医药大学附属医院风湿免疫血液科徐军建教授根据多年临床经验总结、创立的院内制剂，在临床治疗RA方面疗效较好、不良反应少，且患者依从性好，但其具体作用机制尚不明确。本研究建立大鼠佐剂性关节炎模型，以足跖肿胀程度、关节组织病理学形态、血清IL-23、IL-17、IL-6及TNF-α为观察指标，初步探讨虎威通痹汤对佐剂关节炎大鼠IL-23/IL-17炎症轴的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性健康SD大鼠40只，平均体重(120±20)g，由西安交通大学实验动物中心提供，实验动物许可证号为SCXK(陕)2018-001。

1.1.2 主要试剂与仪器：甲氨蝶呤片(国药准字H22022674)；0.9%氯化钠溶液(国药准字H20044024)；IL-17ELISA试剂盒(批号H30018353，武汉华美生物工程有限公司)；IL-23ELISA试剂盒(批号I11018354，武汉华美生物工程有限公司)；TNF-α、IL-6ELISA试剂盒 (批号p001643、p001867，美国eBioscience公司)；完全弗氏佐剂(批号SLBW7430，美国Sigma公司)；苏木素-伊红(HE) 染色试剂(批号2017010301、2017040601，北京雷根生物技术有限公司)；高效液相色谱仪(Prominence型，日本岛津公司)；足趾容积测量仪(PV200型，成都泰盟科技有限公司)；高速离心机(ZX6006型，法国Jouan公司)；超薄切片机(EMUC7型，德国徕卡公司)；光学显微镜(XSP-C204型，武汉光电仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 虎威通痹汤：由薏苡仁20 g，青风藤、龙须藤、忍冬藤、防己、土茯苓、萆薢、桑枝、川牛膝各15 g，山栀子、连翘、威灵仙、虎杖、防风、莪术各10 g，甘草6 g组成。以上中药由陕西中医药大学附属医院中药房提供。

1.2.2 建模、分组与给药：将40只SPF级雄性健康SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、虎威通痹汤组、甲氨蝶呤组，每组10只。除对照组10只外，其余三组大鼠均予右后足垫一次性皮内注射0.1 ml完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠模型[4-5]。造模14 d后开始给药，根据动物体重计算给药剂量[6]。甲氨蝶呤组大鼠予1 mg/kg的甲氨蝶呤灌胃，1次/周；虎威通痹汤组大鼠予16 g/kg(折合生药)的虎威通痹汤灌胃，1次/d；对照组、模型组大鼠于每日同时间给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.3 观察指标

1.3.1 大鼠足跖肿胀度：采用容积法测量并记录各组大鼠造模前后及给药后1、7、14、21、28 d的足容积，并计算足跖肿胀度，肿胀度为治疗前后足跖容积的差值。

1.3.2 HE染色：末次给药后次日麻醉并处死大鼠，取左后肢膝关节滑膜组织于10%甲醛溶液中固定，将固定好的滑膜组织放入石蜡包埋盒中，标注时间及组别，95%乙醇脱水过夜，切片进行HE染色，通过光学显微镜观察关节滑膜组织病理学形态。

1.3.3 血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平：末次给药后次日麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置，3000 r/min,离心15 min，分离血清，采用ELISA法测定各组大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-23、IL-17水平，所有步骤均按照试剂盒说明书规范操作。

2 结 果

2.1 各组大鼠足跖肿胀度比较 见表1。与对照组比较，造模后模型组大鼠足跖肿胀度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，甲氨蝶呤组大鼠足跖肿胀度给药后14 d降低，虎威通痹汤组大鼠足跖肿胀度给药后21 d降低，给药后28 d足趾肿胀度最低。给药后28 d，虎威通痹汤组大鼠足跖肿胀度低于甲氨蝶呤组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠足跖肿胀度比较(mm)

2.2 各组大鼠滑膜组织HE染色 对照组大鼠滑膜组织相对完整，炎症细胞浸润不明显；模型组大鼠滑膜组织水肿、增生，可见较多炎性细胞浸润；虎威通痹汤组、甲氨蝶呤组大鼠滑膜组织受损情况及炎性细胞浸润情况均较模型组改善，且虎威通痹汤组优于甲氨蝶呤组(图1)。

图1 各组大鼠滑膜组织病理学形态(HE染色，×10)

2.3 各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表达比较 见表2。与对照组比较，模型组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α水平均高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，虎威通痹汤、甲氨蝶呤组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α均低，差异有统计学意义(均P<0.05)。与甲氨蝶呤组比较，虎威通痹汤组大鼠血清IL-23、IL-6均低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α表达比较

3 讨 论

RA是临床常见的致残性疾病，且易合并脑卒中、心肌梗死、肺间质纤维化等疾病，给患者家庭和社会带来严重负担[7-8]。虽然现代医学可通过生物制剂、物理治疗等手段稳定RA患者病情，但仅延缓病情进展，且治疗成本较高，不良反应较多，因此寻找价廉效优的治疗方案有重要意义。

虎威通痹汤在临床上多用于关节炎患者伴肌肉或关节红肿热痛、有沉重感、步履艰难等病症的治疗。本方立足于“风寒湿杂至，合而为痹”的基本理论，选用虎杖、威灵仙共为君药，虎杖活血散瘀止痛，威灵仙辛散温通，性猛善走，通行十二经，既能袪风湿，又能通络止痛，为治风湿痹痛要药，两药相合，共成祛风除湿、活血散瘀止痛之功[9]。《本草纲目》云：“藤类药物以其轻灵,易通利关节而达四肢”。中医学认为藤类条达，可舒筋活络，故方中以青风藤、龙须藤、忍冬藤为臣，起疏利关节之功，正如《本草便读》云：“凡藤蔓之属，皆可通经入络。此物善治风疾，故一切历节麻痹皆治之”[10]。风为百病之长，佐以防风、桑枝疏风解表，加强威灵仙之功。久病多瘀，佐以牛膝、莪术以逐瘀通经，加强虎杖散瘀定痛之功。湿热为发病之根本，佐以土茯苓、萆薢、薏苡仁、防己利水渗湿、除痹散结；连翘、山栀子清热散结止痛。甘草为中州之药，能补能和为使，使湿去而土不伤，致于和平也。全方共奏祛风、清热、除湿，活血定痛之功。

IL-23/IL-17炎症轴在多种自身免疫性疾病中起着关键作用。有研究表明，IL-6、IL-17的高表达与RA并发动脉粥样硬化密切相关，是RA合并脑卒中、心肌梗死等的危险因素[11]。动物研究证实，阻断了IL-23/IL-17炎症通路，可减轻RA的滑膜炎症，且大量研究表明IL-17、TNF-α在滑膜炎、骨侵蚀发挥重要作用，IL-6、TNF-α与RA活动程度呈正相关[12-14]。

大鼠佐剂关节炎模型是典型的免疫性炎症模型，是目前最经典、应用最广泛的RA模型建立方法。故本实验选择大鼠为实验对象，建立大鼠佐剂关节炎模型，建模后，模型组大鼠足跖肿胀度高于对照组，HE染色可见大鼠滑膜组织水肿、增生，提示造模成功。与模型组比较，甲氨蝶呤组大鼠足跖肿胀度给药后14 d降低，虎威通痹汤组大鼠足跖肿胀度给药后21 d降低，给药后28 d显著降低。给药后28 d，虎威通痹汤组大鼠足跖肿胀度低于甲氨蝶呤组。虎威通痹汤组和甲氨蝶呤组病理结果均提示：滑膜组织受损情况以及炎症细胞浸润情况较模型组明显改善，说明虎威通痹汤对RA大鼠关节炎有一定的治疗作用，且呈时间依赖性，其疗效可能与虎威通痹汤中虎杖[15]、威灵仙[16-17]、土茯苓[18]、连翘[19]等抗炎、镇痛作用相关。本研究结果表明，虎威通痹汤可降低大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α的表达水平，提示虎威通痹汤治疗RA的机制可能与下调细胞因子IL-6、IL-23、 TNF-α、IL-17分泌有关。与甲氨蝶呤组比较，虎威通痹汤血清IL-23、IL-6水平降低，提示虎威通痹汤可能通过抑制IL-23/IL-17炎症轴发挥治疗作用。

综上所述，虎威通痹汤可改善类风湿关节炎大鼠足跖肿胀程度，减轻滑膜增生，其作用机制可能与抑制IL-23/IL-17炎症通路有关。本研究结果未进行细胞、分子水平相关验证，有待今后进一步深入研究。