盛誉妍，何美霞，游普云，张迎娜，贺笑笑，沈 童，方 华，崔新征，高 峰1,,张清勇2,

1)郑州大学第三附属医院教学办公室 郑州 450052 2)郑州大学河南省医药科学研究院神经免疫重点实验室 郑州 450052 3)河南省人民医院重症肌无力综合诊疗中心 郑州 450003

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是指由抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与、主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors，AChR)的获得性自身免疫性疾病[1-2]。其中介导的抗体包括针对骨骼肌的AChR抗体、肌肉特异性酪氨酸激酶抗体和低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体[3]。MG临床特征是波动性肌无力和易疲劳，肌无力症状随活动而增加，随休息而改善，严重时可累及呼吸肌导致窒息死亡。静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIg)可有效中和循环中的自身抗体并调节免疫反应，以往常用于难治性MG和肌无力危象[4]。皮下注射免疫球蛋白(subcutaneous immunoglobulin，SCIg)作为目前热门的新型免疫疗法已引起人们的关注[5]，但将SCIg运用于MG的日常治疗还处于早期临床研究阶段。为此，我们以实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠模型为研究对象，给予多点SCIg，观察肌力、血清AChR-Ab水平和肌纤维超微结构的变化，探讨SCIg对EAMG的治疗效果，为寻求MG治疗新方法提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物、药品及试剂SPF级C57BL/6雌性小鼠50只，6～7周龄，体重15～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证:SCXK(京)2016-0006。纯化小鼠IgG冻干粉由武汉原谷生物科技有限责任公司合成，批号BMA202006002；鼠源性AChR-α亚基97～116肽段(R97-116)由上海淘普生物科技有限公司合成，批号TP-20057938。HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂均购自美国Sigma公司。小鼠IgG ELISA检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2 EAMG小鼠模型的制备参照Baggi等[6]方法，将R97-116、完全弗氏佐剂、PBS按50 μg、100 μL、100 μL的配比充分混合，制成油包乳剂。首次免疫：于小鼠背部上肩胛2点及双后足垫底部皮下注射乳剂200 μL(含50 μg R97-116)。加强免疫：首次免疫后第4、8及12周进行3次加强免疫，于小鼠背部2点、两后大腿各1点皮下注射R97-116、不完全弗氏佐剂、PBS混合的乳剂200 μL(含50 μg R97-116)。末次注射后第2周对小鼠进行评估。①Lennon评分≥1分[7]。②血清AChR-Ab阳性(ELISA法检测)。③腓肠肌低频重复神经电刺激第4个电位对第1个电位的衰减度大于10%。④新斯的明试验阳性。满足①且②、③、④中任意一项，则认为模型制备成功。

1.3 实验分组随机数字表法选取5只小鼠作为正常组：首次免疫注射等量PBS和完全弗氏佐剂混合乳剂，加强免疫注射等量PBS和不完全弗氏佐剂混合乳剂。其余45只按1.2造模，造模成功18只，随机分为EAMG组4只、泼尼松组4只、SCIg低剂量组5只、SCIg高剂量组5只。正常组及EAMG组给予生理盐水0.2 mL/d灌胃,泼尼松组给予泼尼松9 mg/(kg·d)灌胃,共灌胃2周。SCIg低、高剂量组：每周2次皮下注射IgG，每次至少间隔2 d，每次于4个部位(背部、大腿或臀部,剂量均分)并保持适当距离注射;第1周两组剂量均为2.25 mg/g,第2周分别为2.25、4.50 mg/g[8-9]。

1.4 检测指标及方法

1.4.1Lennon评分 小鼠第1次加强免疫后每隔1周测肌力，进行Lennon评分：正常肌力为0分；休息时不明显、四肢较弱为1分；精神不振、前肢无力为2分；肌肉无力、无法抓握甚至呼吸困难为3分；接近死亡或死亡为4分。介于两种表现之间计为0.5、1.5或2.5分。

1.4.2血清AChR-Ab水平、IgG含量测定 治疗前剪尾、给药2周后麻醉摘眼球采集小鼠血液标本，静置离心后取血清。血清AChR-Ab水平测定：用R97-116(5 mg/L)100 μL/孔包被96孔板，加入1∶10稀释的小鼠血清50 μL/孔，37 ℃温浴30 min，洗涤，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG孵育30 min，洗板，加入底物TMB显色，颜色最深时加2N硫酸溶液终止反应，采用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度，以此表示血清AChR-Ab水平。血清IgG含量测定采用ELISA法，按照试剂盒说明书操作。

1.4.3外周血嗜中性粒细胞与淋巴细胞计数 将摘眼球取的血样置于EDTA抗凝管中，用全自动血细胞分析仪测定白细胞计数(WBC)、嗜中性粒细胞计数(NEUT)和淋巴细胞计数(LYMPH)，计算嗜中性粒细胞和淋巴细胞比值(NLR)。

1.4.4骨骼肌超微结构电镜观察 肌肉取材在低温下进行，提前预冷手术器械。小鼠麻醉后，固定于平板上，剪开皮肤，取腓肠肌并切割修成1 mm3大小，于戊二醛中固定2 h(4 ℃)，送至河南中医药大学中医药科学院进行电镜观察。

1.5 统计学处理采用SPSS 23.0进行数据分析。应用重复测量数据的方差分析比较EAMG组、泼尼松组、SCIg低剂量组、SCIg高剂量组小鼠Lennon评分和血清AChR-Ab水平；应用单因素方差分析比较5组小鼠血清IgG含量及外周血细胞计数，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠Lennon评分和血清AChR-Ab水平测定结果见表1。泼尼松组、SCIg组治疗后血清AChR-Ab水平和Lennon评分均较治疗前降低，SCIg高剂量组降低程度大于低剂量组。

表1 4组小鼠Lennon评分和血清AChR-Ab水平的比较

2.2 小鼠血清IgG含量及外周血细胞计数结果见表2。与正常组相比，EAMG组血清IgG含量升高，NEUT增加，LYMPH降低，NLR升高。与EAMG组相比，泼尼松组血清IgG含量、WBC、NEUT、LYMPH均降低。与EAMG组相比，SCIg高剂量组血清IgG含量、NEUT和NLR降低。

表2 5组小鼠血清IgG含量、外周血细胞计数及NLR的比较

2.3 电镜下骨骼肌超微结构见图1。正常组肌纤维结构完整正常；EAMG组肌纤维间隙相对增宽，肌丝溶解紊乱，线粒体数量明显减少，出现云絮状病变及空泡化；泼尼松组肌纤维结构紊乱，肌丝溶解，线粒体嵴断裂、空泡化；SCIg低剂量组肌纤维结构较清晰完整，肌纤维较稀疏，线粒体空泡化；SCIg高剂量组线粒体嵴致密度相对较为均匀，结构较为清晰，排列规律性恢复较好。

A：正常组；B:EAMG组；C:泼尼松组；D:SCIg低剂量组；E:SCIg高剂量组;1:×5 000;2:×30 000;箭头指示为线粒体嵴图1 5组小鼠骨骼肌线粒体超微结构电镜观察

3 讨论

泼尼松是MG的一线免疫治疗药物，主要通过免疫抑制，缓解患者的临床症状，有效控制MG，但典型的治疗方案会导致至少30%的患者因给药剂量和持续时间而发生不良反应[10]。治疗性IgG由从几千名健康献血者血浆中获得的正常IgG组成，对自身免疫性疾病有显著的疗效[8]。IgG以IVIg或SCIg的形式施用，由于IVIg有治疗限制并可能导致全身不良事件，因此SCIg的使用变得越来越普遍，SCIg目前已成为MG的新兴治疗选择。

本研究结果显示，泼尼松和SCIg治疗2周后，EAMG小鼠症状评分降低，肌无力症状缓解，血清AChR-Ab水平下降，说明SCIg与泼尼松一样，可降低MG自身抗体水平，达到治疗目的；泼尼松组EAMG小鼠治疗后WBC、NEUT、LYMPH均有一定程度地降低，表明泼尼松在降低MG自身抗体浓度的同时，可导致小鼠细胞免疫功能减弱，增加感染的风险。而SCIg组EAMG小鼠治疗后WBC、LYMPH变化不明显，表明SCIg不影响小鼠的淋巴细胞数量，避免了感染的风险。本研究结果还显示，SCIg高剂量组小鼠骨骼肌肌纤维线粒体嵴致密度均匀，结构较为清晰，排列恢复，说明SCIg能显著改善EAMG小鼠肌纤维及线粒体功能。

越来越多的证据[11-13]表明，慢性炎症可能与 MG的发病关系密切。NLR代表嗜中性粒细胞和淋巴细胞水平之间的平衡，可反映慢性炎性疾病的炎症状况[14-15]。NLR计算简单，且稳定性较强[16-18]。有研究[19]证实 MG 患者NLR 明显高于健康对照，且可能与 MG 严重程度有关。本研究中，EAMG组小鼠NLR明显高于正常组；治疗2周后，SCIg高剂量组小鼠NLR下降，说明高剂量SCIg可以降低EAMG小鼠体内的炎症反应水平。

综上所述，SCIg可能通过免疫调节作用，降低机体内炎症反应水平，改善肌纤维线粒体的超微结构，从而改善EMAG小鼠的肌肉能量代谢、改善神经肌肉传导，缓解肌无力症状；同时SCIg并不影响机体内淋巴细胞的数量，避免了感染的风险。SCIg有可能成为MG及其他自身免疫性疾病治疗方案的新选择。