李刚 韩楠楠 张可 李恒杰

急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）是我国常见的毒性气体损伤[1]。一氧化碳（carbon monoxide，CO）可与血液中的血红蛋白相结合形成碳氧血红蛋白（carboxyhemoglobin，COHb），降低血红蛋白的携氧能力，造成相关器官损伤，严重者可导致死亡。ACOP 易损伤心脏，可导致心肌损伤、心律失常、心功能不全及急性心肌梗死[2-3]。本团队前期研究结果显示，红景天苷对ACOP 导致的心肌损伤有保护作用[4]，但未明确红景天苷对ACOP 心肌损伤治疗作用的具体机制。缺氧诱导因子的活性亚基为缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factot-1α,HIF-1α），此外磷脂酰肌醇-3-激酶/ 蛋白激酶B（phosphatidylinosition-3-kinase/Akt，PI3K/Akt） 信号通路在心脏功能调节和代谢过程中扮演着重要角色，可调节心肌肥厚、心肌纤维化和心肌重塑，其表达与心血管疾病的发生发展关系密切。有研究表明红景天苷可通过PI3K/Akt 促进HIF-1α 蛋白稳定表达[5]。本研究旨在探讨PI3K/Akt通路在红景天苷对ACOP 心肌损伤治疗过程中的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 选择SPF 级成年SD 大鼠48 只（由上海吉辉实验动物有限公司提供），雌雄各半，平均体重（280±20）g，饲养于20～25 ℃、相对湿度范围40%～70%的动物房中2 周。本研究经杭州赫贝科技有限公司动物伦理委员会批准（批准号：HB20200 119090021LG-B）。

1.2 主要试剂与仪器 99.99%高纯度CO 气体由泸州西南化工研究所制备（批号：781941）；红景天苷由成都德瑞可生物科技有限公司提供（批号：DRK-1900-943617，规格：5 mg/ 支），0.9%氯化钠注射液由浙江大冢制药有限公司提供（批号：20200416，规格10 ml/ 支）。PI3K/Akt 拮抗剂由美国MedChem Express 有限公司提供（批号：52336）；PI3K/Akt 激动剂由美国Santa Cruz 公司提供（批号：11928）；白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、HIF-1α ELISA 试剂盒均由上海江莱生物提供（批号分别为：20268、10484、18090，113276）；红细胞裂解液由杭州联科生物提供（批号：MR0504-500；CD284）；PI3K/Akt/HIF-1α 抗体由美国eBioscience 提供（批号：12-9041-80）。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 采用改良式腹腔注射CO 法制备大鼠重度CO 中毒模型[6]，即首次100 mL/kg CO 腹腔注射，每间隔4 h 追加1 次，追加剂量为首次剂量的一半（即50 mL/kg），共追加3 次，然后测定COHb，＞50%即为模型制备成功。

1.3.2 用药方法 模型制备成功后，采用随机数字表法将其分为4组，每组12 只，分别为单纯红景天苷组（红景天苷组）、红景天苷加PI3K/Akt 拮抗剂组（合并拮抗剂组）、红景天苷加PI3K/Akt 激动剂组（合并激动剂组）及对照组。4组大鼠均采用尾静脉注射方法予以红景天苷（10 mg/kg）、红景天苷（10 mg/kg）加PI3K/Akt 拮抗剂（0.5 mg/kg）、红景天苷（10 mg/kg）加PI3K/Akt 激动剂（0.5 mg/kg）、0.9%氯化钠注射液（5 mL/kg）注射。

1.3.3 大鼠COHb、存活率及心肌损伤标志物测定模型制备后立即眶下静脉丛采血1 mL，采用全自动血气分析仪测定COHb。记录4组大鼠用药后24 h存活率。用药后24 h 眶下静脉丛采血1 mL，采用全自动生化分析仪检测4组天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、肌酸激酶MB 同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）水平。

1.3.4 心肌组织HE 染色 两次采血后，予腹腔注射5%水合氯醛6 mL/kg 麻醉，立即打开胸腔，无菌条件下分离并取出心脏，取一半置于-80 ℃液氮保存、备用，余下部分于4%甲醛溶液中固定3 d，切成2 mm×2 mm×2 mm 左右的立方体小块，流水冲洗组织中的甲醛。分别置于80%、90%、95%、100%的乙醇中浸泡40 min 脱水，二甲苯浸泡30 min，浸于液体石蜡4 h。使用石蜡包埋机对组织块进行包埋，包埋后使用切片机切成4 μm 的石蜡薄片，放入65 ℃恒温箱中12 h。脱蜡后依次用苏木素、酸性乙醇、氨水、伊红进行染色，最后用树胶封片风干，显微镜下观察心肌组织病理学改变。

1.3.5 心肌组织炎症因子及HIF-1α 水平测定取出-80 ℃液氮中的心肌组织，化冻后放入体积比为1：5 的磷酸盐缓冲液中进行组织匀浆形成匀浆液，然后将匀浆液放置在4 ℃下，以离心半径为22.5 cm、3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，采用ELISA 法测定心肌组织中炎症因子（IL-6、TNF-α、NF-κB）及HIF-1α 的水平，测定过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.6 心肌细胞中PI3K/Akt/HIF-1α 表达水平测定 取吸除上清液的心肌组织悬液，加入500 μL磷酸盐缓冲液，3 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入3 mL 红细胞裂解液，室温裂红5 min 后3 000 r/min 离心5 min，弃上清液。取100 μL 心肌细胞悬液，按照抗体说明书的步骤和要求加入1 μL CD284（PI3K/Akt/HIF-1α）抗体，常温避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测PI3K/Akt/HIF-1α表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠COHb、存活率及心肌损伤标志物水平比较 见表1。

由表1 可见，4组大鼠存活率、AST、LDH、CK、CK-MB 水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。4组大鼠COHb 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。红景天苷组、合并激动剂组大鼠存活率高于对照组、合并拮抗剂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。红景天苷组、合并激动剂组AST、LDH、CK、CK-MB 水平均低于对照组、合并拮抗剂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 4组大鼠COHb、存活率及心肌损伤标志物水平比较

2.2 4组大鼠心肌组织病理学改变 见图1。

由图1 可见，红景天苷组炎症细胞浸润，组织间充血，肌纤维排列尚整齐，未见肌纤维断裂。合并拮抗剂组部分肌纤维断裂，炎细胞浸润，组织间充血。合并激动剂组肌纤维排列较整齐，见少量炎细胞浸润，未见明显出血。对照组肌纤维排列紊乱，部分肌纤维断裂，组织间大量红细胞渗漏，可见炎细胞浸润及部分细胞水肿。

图1 4组大鼠HE 染色心肌组织病理学改变（A：红景天苷组；B：合并拮抗剂组；C：合并激动剂组；D：对照组。黑色箭头指炎症细胞浸润，灰色箭头指出血，白色箭头指肌纤维断裂，×10）

2.3 4组大鼠心肌组织炎症因子及HIF-1α 水平比较 见表2。

由表2 可见，4组大鼠IL-6、TNF-α、NF-κB、HIF-1α 水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与对照组、合并拮抗剂组比较，红景天苷组和合并激动剂组IL-6、TNF- α、NF-κB 水平较低，HIF-1α 水平较高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与合并激动剂组比较，红景天苷组IL-6、TNF-α、NF-κB 水平较高，HIF-1α 水平较低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 4组大鼠心肌组织炎症因子及HIF-1α 水平比较（ng/mL）

2.4 4组大鼠心肌细胞PI3K/Akt/HIF-1α 表达水平比较 见图2。

由图2 可见， 红景天苷组大鼠心肌细胞PI3K/Akt/HIF-1α 表达水平为（18.83±0.13）%，合并拮抗剂组表达水平为（5.92±0.33）%，合并激动剂组表达水平为（20.60±0.32）%，对照组表达水平为（6.62±0.08）%。与对照组、合并拮抗剂组比较，红景天苷组和合并激动剂组PI3K/Akt/HIF-1α 表达水平较高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与合并激动剂组比较，红景天苷组PI3K/Akt/HIF-1α 表达水平较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 4组大鼠心肌细胞磷脂酰肌醇-3- 激酶（PI3K）/ 蛋白激酶B（Akt）/ 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达水平比较（A：红景天苷组；B：合并拮抗剂组；C：合并激动剂组；D：对照组）

3 讨论

红景天苷是藏药红景天的提取物，我国古时对红景天的应用在藏医《四部医典》和《本草纲目》均有记载。近年多项研究表明，红景天苷有心脏保护作用，可以抑制心肌细胞的变性、坏死和凋亡，减弱心脏缺血再灌注损伤，增加心肌存活率，减少心肌凋亡，从而改善心脏功能[7-8]。ACOP 的机制为CO 与血液中的血红蛋白结合，形成COHb，进而引起各器官、组织缺氧，而心肌是常累积的器官之一。前期研究结果已证实，红景天苷对ACOP 导致的心肌损伤有保护作用[4]。

本研究结果显示，红景天苷组存活率较高，AST、LDH、CK、CK-MB 水平较低，心肌细胞炎症浸润、出血、肌纤维损伤较轻，心肌组织IL-6、TNF-α、NF-κB 水平较低，HIF-1α 表达水平较高；合并拮抗剂组不但未表现出单纯给予红景天苷治疗的效果，而且其心肌损伤程度和对照组相似，同时HIF-1α 表达水平较低，而合并激动剂组存活率较高，心肌酶升高程度较低，心肌细胞接近正常大鼠，心肌组织IL-6、TNF-α、NF-κB 水平较低，同时HIF-1α 表达水平较高。本研究证实，PI3K/Akt 通路激活、拮抗对HIF-1α 表达起到了关键性作用。

有关研究显示，PI3K/Akt 信号通路在心脏功能调节和代谢过程中扮演着重要的角色，HIF-1α 是HIF-1 的激活亚基，是PI3K/Akt 信号通路的下游调节靶点，是适应缺氧环境的调节器，可以通过增强血管内皮生长因子的表达调节血管生成影响HIF-1α蛋白表达水平，机体在遭受低氧刺激后，HIF-1α 水平会出现改变[9-10]。这与本研究中PI3K/Akt 通路激活、拮抗对HIF-1α 影响相一致。

该实验对4组大鼠心肌细胞悬液中PI3K/Akt/HIF-1α 表达进行了检测，结果显示，红景天苷组PI3K/Akt/HIF-1α 表达明显增加，合并拮抗剂组接近于对照组，而合并激动剂组最高，这也与ACOP 大鼠存活率、心肌损伤程度、炎症因子表达相一致。

红景天苷作为一种应用较久的中药，对心肌损伤保护作用的研究一直没有间断过。但是各项研究大部分是表述其治疗作用，作用机制尚未完全明了。文献显示，对于ACOP，临床常用高压氧、醒脑药物治疗，而对心肌损伤治疗的药物却比较少[11-12]。红景天苷对ACOP 中毒心肌损伤鲜有研究，这也是本研究设立的原由和初衷。

综上所述，本研究证实了红景天苷对ACOP 心肌损伤的保护作用，同时，PI3K/Akt 通路在该治疗过程中起到了至关重要的作用，至于是否有其他途径并存，有待于进一步研究。