邹 雯，王婷婷，王一江 （南京医科大学附属江苏盛泽医院呼吸内科，江苏苏州 215200）

慢阻肺急性加重（acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD）患者气喘、咳嗽咳痰等症状加重，AECOPD 会增加患者医疗开销，加重患者疾病负担[1]。目前，气道炎症及细菌感染被认为是慢阻肺（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）的主要致病机制。簇分化抗原64（cluster of differentiation antigen ,CD64）是激活单核细胞及粒细胞，引起炎症的重要分子物质，当发生细菌感染时，外周血单核细胞表面CD64 表达将异常上升，史萌萌等[2]研究发现，检测外周血CD64 表达水平在预测AECOPD 患者不良预后中具有一定的价值。此外，机体免疫功能下降也与COPD 发病相关，Toll 样受体（toll-like receptors,TLR）是天然免疫中新发现的一类模式识别受体家族，单核细胞主要表达Toll 样受体2（To ll-like receptor 2, TLR2）与Toll 样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4），TLR 可作为病原相关分子模式识别受体（pattern-recognition receptors, PRR）与配体直接结合，参与机体非特异性免疫[3,4]。谢圆媛等[5]研究发现，不吸烟的COPD 稳定期患者外周血TLR2 及TLR4 水平明显高于AECOPD 患者及吸烟患者，且外周血TLR2 及TLR4 水平与患者血清炎症因子水平间有较高的相关性，提示其可能参与COPD 发生及发展。以上研究表明，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平可能与COPD 及AECOPD 的发生及发展有关，但相关研究较少，故本研究拟通过检测AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平，分析其在预测AECOPD 患者预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 将南京医科大学附属江苏盛泽医院2017.06～2020.06 期间收治的96 例慢阻肺急性加重（AECOPD）患者纳为研究对象，同时将30 例稳定期COPD 患者纳为稳定组，30 例健康志愿者纳为对照组。①纳入标准：COPD 患者均符合《慢阻肺诊断、治疗与预防全球倡议（GOLD）》中相关诊断标准，AECOPD 患者具有呼吸困难、慢性咳嗽咳痰症状，持续性气流受限，短期内咳嗽、喘息、咳痰等症状加重，需改变治疗方案；稳定期患者病情稳定持续时间超过1 个月患者；健康志愿者为健康体检合格，无COPD 病史、慢性咳嗽、喘息、咳痰者。②排除标准：排除参与研究前15 天内使用糖皮质激素者；并发恶性肿瘤者；并发其他部位感染者。③病例资料：对照组男性19 例，女性11 例，年龄55～85 岁，平均年龄72.45±13.33 岁；AECOPD 组男性63 例，女性33 例，年龄56～87 岁，平均年龄71.15±12.03 岁，COPD 组男性19 例，女性11 例，年龄55～87 岁，平均年龄73.15±12.69 岁。三组年龄及性别比例无显著性差异（P>0.05），本研究经医院伦理委员会批准，参与者均知情且签署同意书。

1.2 仪器与试剂 美国BD 公司FACS Calibur 流式细胞仪，IL-6 采用电化学发光法检测，PCT 采用发光免疫法检测，试剂盒均购自美国Beckman 公司，白细胞计数（WBC）由美国Beckman 公司全自动血细胞分析仪检测，CD64-PE 单抗（Clone:10.1，Cat No12-0649-73）、鼠IgG1-PE（Clone:P3.6.2.8.1，Cat No12-4714-82）均购自美国eBioscience 公司，肺功能检测仪为麦邦MSA99。

1.3 方法 ①外周血单个核细胞（PBMC）提取：采集被研究者空腹静脉血5ml，EDTA 抗凝，采用Ficoll Paque 分离液提取患者外周血PBMC。②流式细胞仪检测CD64 表达水平：分别于两支试管内加入CD64-PE（测定）与鼠IgG1-PE（对照），分别加入全血50μl，避光环境中静置15min，滴加溶血素50μl，弃上清液，300×g 离心5min，弃上清液，加入等渗盐水洗涤后，使用流式细胞器检测CD64 表达水平，单核细胞表面的CD64 表达采用相对荧光强度（RFI）表示，RFI=目的细胞CD64 平均荧光强度/目的细胞阴性对照荧光强度。③ 流式细胞仪检测PBMC TLR2 及TLR4 的表达：经Cellquestpro 统计软件获取分析，共收获10 000个细胞，以APC-CD14/SCC 散点图设单核细胞门R1，以FSC/SCC 散点图设淋巴门R2，细胞碎片根据SSC 特征排除，单核细胞中TLR2 及TLR4 表达以直方图表示，以平均荧光强度（MFI）表示单核细胞及淋巴细胞中TLR2 及TLR4 表达强度。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较使用单AVNA 检验，检验有意义者，两两比较采用q检验；计数资料用[n(%)]表示，两组间比较采用χ2检验，用二元Logistic 回归计算联合检测AECOPD 再次复发的预测值，绘制受试者特征工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）评价单个或多个指标联合检测预测AECOPD 再次复发的性能，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比较 见表1。AECOPD 组及COPD 组外周血CD64 水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且AECOPD 组CD64 水平高于COPD 组，差异有统计学意义（t=4.466,P<0.05），AECOPD 组及COPD组外周血TLR2 及TLR4 水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且AECOPD 组外周血TLR2 及TLR4 水平高于COPD 组，差异有统计学意义（t=2.249, 2.037, 均P<0.05）。

表1 三组外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比较(±s)

表1 三组外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比较(±s)

项 目 对照组（n=30） COPD 组（n=30） AECOPD 组（n=96） F P CD64（MFI） 26.74±5.14 32.69±6.43 39.69±7.79 51.774 0.000 TLR2 140.0 3±28.74 169.79±29.07 181.15±22.44 26.957 0.000 TLR4 153.65±35.14 186.25±34.15 200.58±33.47 21.488 0.000

2.2 AECOPD 及COPD 组患者临床指标比较 见表2。AECOPD 组患者FEV1/FVC 水平低于COPD组，差异有统计学意义（t=5.523,P<0.05），血清PCT，IL-6 及WBC 水平高于COPD 组，差异均有统计学意义（t=12.443, 8.019, 3.690, 均P<0.05），两组年龄、性别比例、吸烟史及FEV1%pred 水平差异均无统计学意义（P>0.05）。

表2 AECOPD 及COPD 组患者临床指标比较

2.3 不同预后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平比较 见表3。随访6 个月，96 例AECOPD 患者中共20 例患者因再次急性复发入院，再次复发者首次入院时外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平均高于无复发者，差异均有统计学意义（P<0.05）。

表3 不同预后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比较（MFI）

2.4 AECOPD患者外周血CD64，TLR2 及TLR4水平与其他临床指标间的相关性分析 见表4。AECOPD 患者外周血CD64 与其吸烟史、PCT，IL-6水平呈正相关，与FEV1/FVC 呈负相关，差异有统计学意义（r=0.31, 0.33, 0.16, -0.45, 均P<0.05），TLR2 与其FEV1/FVC 呈负相关，与PCT 水平呈正相关，差异有统计学意义（r= -0.35, 0.34,P<0.05），TLR4 与其他临床指标无相关性（P>0.05）。

表4 AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平与其他临床指标间的相关性分析

2.5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在预测AECOPD预后中的价值 见表5，图1。绘制ROC 曲线发现，血清CD64，TLR2 及TLR4 在预测AECOPD 患者再次急性复发中均具有良好的应用效能，各指标单独应用时以TLR2 应用效能最高，其AUC=0.805，95%CI(0.679～0.931)，三指标联合应用的预测效能最高，AUC=0.833，95%CI(0.703～0.964)。

表5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在预测AECOPD 预后中的价值

图1 外周血CD64，TLR2 及TLR4 在预测 AECOPD 预后中的价值

3 讨论

COPD 是一种以持续性气流受限为主要特征的慢性呼吸性疾病，其患病率高，是目前重要的公共卫生问题，COPD 病因复杂，病情多变，当疾病急性发作时，死亡率也较高。准确评估患者病情严重程度，预测其预后，在疾病的治疗中具有重要的意义。筛选适当的血生化指标，用于临床AECOPD病情及预后评估，是目前研究的热点。胡小燕等[6]研究发现，血清降钙素原（procalcitonin, PCT）以及B 型脑利钠肽（B type brain natriuretic peptide, BNP）在诊断AECOPD 并发心力衰竭中具有良好效能，提示血生化指标在AECOPD 中的应用价值较高。本研究以CD64，TLR2 以及TLR4 作为研究指标，旨在探讨以上指标在AECOPD中的应用价值。

CD64 是IgG Fc 段受体Ⅰ，中性粒细胞活化的标志物，是一种高亲和性受体，主要于单核细胞与巨噬细胞表面表达。CD64 是连接机体体液免疫及细胞免疫的桥梁，参与细胞吞噬、清除免疫复合体、刺激炎性介质释放等多种生理病理过程[7-8]。单核细胞是巨噬细胞的前体，本院研究发现，AECOPD患者外周血单核细胞上CD64 表达水平明显高于COPD 患者及健康志愿者，且与患者肺功能指标FEV1/FVC，炎症指标CRP，PCT 间存在相关性，说明外周血CD64 水平升高在反映AECOPD 患者机体肺功能及炎症反应强度中具有一定的应用价值。罗成等[9]研究发现，脓毒症肺损伤者外周血CD64指数明显高于单一的脓毒症患者，且CD64 水平与炎性指标CRP 间呈正相关，与本文研究结论相似。有研究表示，IL-6 及CRP 等炎性因子可与单核细胞上的CD64 相互结合，诱导黏附的单核细胞释放CCL2，CCL3 等趋化因子，减少单核细胞相应趋化因子受体的表达，进而减少单核细胞对趋化因子的诱导移行，导致单核细胞大量定居在气管内，募集更多的循环炎症细胞，加重患者病情[10]。以上研究均证实，CD64 在提示COPD 病情严重程度中具有一定的价值，且本文通过绘制ROC 曲线发现，CD64 在预测AECOPD 预后中的AUC=0.756，进一步说明CD64 在预测AECOPD 患者预后中的价值。

除炎症的影响外，COPD 的发生及发展与患者机体免疫力之间也存在密切联系，故筛选合适的免疫性指标，用于COPD 病情的评估，也具有一定的研究意义。其中，Toll 样受体（TLR）属于天然免疫系统，属于模式识别受体家族，是天然免疫与适应性免疫之间的桥梁。感染是引起COPD 及AECOPD 的重要原因，作为宿主防御体系的重要成员，TLR 的表达分布及功能可能与COPD 间存在密切的关系[11]。

TLR2 可通过激活机体免疫细胞，促进炎症介质及趋化因子的释放[12]。TLR4 是脂多糖（LPS）受体复合物中的重要组成部分，TLR4 调节LPS 促使免疫细胞与非免疫细胞释放致炎性细胞因子及化学因子导致内毒素性休克过程。细菌感染可通过刺激树突状细胞通过TLR4 途径促使β2 防御素产生增多[13]。本研究发现，AECOPD 患者外周血核细胞中TRL2 及TRL4 水平明显高于COPD 组及健康志愿者，提示AECOPD患者免疫系统处于活化状态，作为机体一线防御功能的单核细胞，其在进入靶器官前处于一种活化状态，能表达多种模式识别受体，识别靶器官抗原[14]。TRL2 及TRL4 高表达可能促进AECOPD 患者外周血单核细胞活化，TLR 通过激活患者机体免疫细胞，促进炎症介质及趋化因子的释放，募集更多的炎症细胞浸润于气管内，加重患者临床症状[15]。

相关性分析提示，AECOPD 患者外周血单核细胞TLR2 表达水平与其FEV1/FVC 呈负相关，与PCT 水平呈正相关，而TLR4 与其他临床指标无相关性，这可能与本研究样本有限相关。此外，随访半年，统计发现，半年内AECOPD 再次复发者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平明显高于未复发者，绘制ROC 曲线发现，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平在预测AECOPD 再次复发中具有良好的效能，三者联合应用则可有效提高各项指标单独应用时的应用效能。外周血单核细胞CD64，TLR2及TLR4 的检测方法简单，取材方便，且在反映AECOPD 病情中具有较好的效能，可作为临床评估AECOPD 预后的可靠指标，但本研究所纳入的样本量较小，且为单中心研究，患者信息存在时效性差，在病例选择上也存在选择偏倚，后应扩大研究样本以控制偏倚。

综上所述，AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平均较COPD 者明显升高，且其在预测患者半年内再次急性复发中具有良好的效能，有望作为临床预测AECOPD 患者预后的参考指标。