杨 英， 张文华，丁 铭， 吴 翔

(1.陕西省第四人民医院重症医学科 ,西安 710043; 2.西安交通大学医学院基础医学院,西安 710012)

心力衰竭（heart failure, HF）是以系统性灌注为特征的临床综合征，由于心脏功能受损，其不足以满足人体的代谢需求，全球估计患病率>3 770 万[1]。尽管实质性疗效与基于证据的疗法相关，例如血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管紧张素受体阻滞剂（angiotensin receptor blocker，ARB）、醛固酮拮抗剂和β-肾上腺素能受体阻滞剂（β-受体阻滞剂），但不良的临床结果仍然是主要公众健康问题，并且该综合征的患病率在全球范围内继续扩大[2]。因此，急需开发针对新靶标或基于新机制的新型治疗药物。

心肌肌浆网Ca2+-ATPase 2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA2a）调节细胞内钙的处理，在心脏收缩和舒张中起关键作用[3]。在压力超负荷引起的心力衰竭的动物模型中，SERCA2a mRNA和蛋白的表达水平显著降低[4-5]。因此，通过基因修饰增加SERCA2a 的表达或活性被认为是解决心力衰竭的一种革命性方法[6-7]。研究表明，通过腺病毒基因转移SERCA2a 在肌细胞中的过度表达导致收缩力增加和瞬时钙的更快松弛，进而改善压力超负荷引起的心力衰竭动物的心肌功能[8]。最近，在压力超负荷引起的心力衰竭小鼠模型中，发现组蛋白表观遗传修饰可调节SERCA2a[9]，这表明SERCA2a 的表观遗传调控可能代表预防心力衰竭的新机制。

川芎嗪（ligustrazine，LGSZ）已被证明对人类的病理和生理过程，尤其是心血管疾病具有多重影响[10-11]，其注射液临床防治心力衰竭疗效确切，但是，LGSZ预防心力衰竭的表观遗传机制仍不清楚，推测LGSZ可能通过调节SERCA2a参与心衰防治。为验证上述结果，本研究建立心衰小鼠动物模型，探讨LGSZ 对SERCA2a 表达的影响及其可能的机制，具体报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年雄性小鼠C57BL/6（8～10周大）购自实验动物中心。动物饲养和实验过程遵循中国医学科学院动物伦理委员会相关规定。将小鼠饲养在单独通风的笼子中（25℃，湿度55～65%），光照/黑暗周期为12h，自由饮食。将动物随机分为四组，即假手术组（SHAM）、TAC 组、TAC + LGSZ 组和SHAM + LGSZ 组，每组10 只小鼠。TAC + LGSZ 和SHAM + LGSZ 组的小鼠在手术后每天一次通过腹膜内注射用单剂量（50 mg / kg /天）的LGSZ（阿拉丁，中国）治疗，持续12 周。

1.2 仪器与试剂 超声为加拿大Visual Sonics 公司的Vevo 2100 超声高分辨率成像系统，图像拍照采集采用日本尼康DS-Fi3 显微镜相机，英国Syngene公司的G-BOX 成像系统UK。

RNA 提取试剂盒（Bioteck，中国），蛋白质提取试剂盒（Key-GEN Bio-TECH，中国），oligo dTadaptor 引物和AMV 逆转录酶试剂盒（TaKaRa，日本），SYBR Green Real Master Mix 试剂盒（Tiangen，中国），SERCA2a（Abcam，美国）和GAPDH（Arigo，台湾），ChIP 分析试剂盒，GATA4 及Mef2c（Abcam，美国），甲醛（SigmaAldrich，美国），HDAC1 活性测定试剂盒（BioVision，美国）。

1.3 方法

1.3.1 微创主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）： 使用微创TAC 方法造模[12]。通过吸入1.5%～2.5%的异氟烷麻醉小鼠，并在整个过程中使用加热垫保持体温在36～37℃之间。在胸骨上切迹的水平切出一个长度为7～10 mm 的水平皮肤切口。然后，甲状腺缩回并且胸骨暴露。在胸骨上切下5mm 的纵向切口，缩回胸腺，以便在低倍放大下观察主动脉弓。在弯曲的27 号针头的引导下，将6-0 丝线缝合穿过无名氏动脉和左颈总动脉起点之间的主动脉弓。将另一个27 号针头放置在主动脉弓旁边，并将缝合线整齐地绑在针头和主动脉周围。结扎后，取下针头。用4-0 尼龙缝合线缝合皮肤，让小鼠在加热垫上干净的笼子中完全康复。丁丙诺啡每天一次皮下给药，持续3 天，用于术后镇痛。观察动物的术后健康状况和手术部位，并每天记录两次，共7 天，直到缝线被移除，然后每天给药一次，持续3 个月。

1.3.2 超声心动图：使用Vevo 2100 高分辨率成像系统进行超声心动图研究。所有测量均由同一人执行。用1.0%～1.5%的异氟烷麻醉小鼠，然后将它们放在加热垫上。用脱毛膏去除心前区的毛发。拍摄B 模式图像以测量心室和主动脉结构，拍摄M 模式图像以测量心室功能。拍摄P 模式图像以测量血流速度。分析所有数据以评估TAC 效果。手术后3 天，经胸多普勒超声心动图检查TAC 效果。手术后12周经胸腔超声心动图检查后，用异氟烷处死小鼠并收集心脏。

1.3.3 苏木素-伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色：心脏组织用4g/dl 多聚甲醛固定，用乙醇脱水，包埋在石蜡中，切成5mm 切片，然后用苏木素-伊红染色。于400 倍放大下拍摄四组小鼠的心室切片照片（尼康，日本）。

1.3.4 实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）：使用Bioteck RNA提取试剂盒提取总RNA。使用oligo dT-adaptor 引物和AMV 逆转录酶试剂盒从500～1 000 ng RNA中逆转录cDNA。使用SYBR Green RealMaster-Mix 试剂盒进行RT-PCR 分析，检测cDNA。量化SERCA2a 的mRNA 表达水平，并以GAPDH标准化样品中的RNA 水平。SERCA2a 的为5’-T CGACCAGTCAATTCTTACAGG-3’ 和5’-CAGGG ACAGGGTCAGTATGC-3’，GAPDH的引物序列为5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3’ 和5’-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3’。

1.3.5 蛋白质印迹分析：使用Key-GEN Bio-TECH蛋白质提取试剂盒，从心脏组织中提取总蛋白质，然后使用BCA 分析法（BioTeke Biotechnology，中国）进行定量。在12g/dl SDS-PAGE 凝胶上分离总蛋白（每泳道50μg）并转移到PDVF 膜上。使用SERCA2a 和GAPDH 特异性一抗，通过蛋白质印迹分析与PDVF 膜结合的蛋白质。使用G-BOX 成像系统分析和定量条带强度。

1.3.6 染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）测定：使用ChIP 分析试剂盒进行ChIP 实验。心脏组织均质化后，将1g/dl 甲醛添加到样品中，以使蛋白质与DNA 交联。然后，使用超声波（Bioruptor UCD-200）将交联DNA 片段化成小片段（500～1 000 bp）。使用特异乙酰化组蛋白3（AcH3），H3 中的赖氨酸4（lysine 4 of hisAcH3K4），H3 中的赖氨酸9（AcH3K9），组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylases 1，HDAC1），GATA4 和Mef2c 的单克隆抗体沉淀蛋白质-DNA 复合物。抗RNA 聚合酶抗体用作阳性对照，抗小鼠IgG 用作阴性对照。去除交联的蛋白质-DNA 复合物，并提取DNA。设计特定的qPCR 引物来确定Atp2a2 近端启动子区域附近的AcH3，AcH3K4 和AcH3K9 的水平。用于扩增SERCA2a 启动子的qPCR 引物序列如下：5’-AGC CAAG GACACCAGTGC-3’ 和5’-GGGATAGAGCG CG GAGTT-3’。

1.3.7 HDAC1 活性测定：使用HDAC1 活性测定试剂盒确定HDAC1 活性。简而言之，在蛋白质提取和蛋白质浓度测量之后，向每个500μl 反应中添加6μl HDAC1 抗体或对照抗体，并将该反应在4℃下孵育过夜。将蛋白质-A / G（25μl）添加到每个反应中，在4℃孵育1h。然后将每个反应在4℃下以14 000×g 离心10s，并弃去上清液。随后将包含HDAC 分析缓冲液和HDAC1 底物的反应化合物添加到每个反应中，并在37℃下孵育2h，向每个试管中加入20μl 显影剂，并在37℃下孵育30min。按照说明稀释AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素）标准品，对于每份100μl 的反应，读取Ex / Em = 380nm/500 nm 的荧光（SYNERGY / H1 微板读数器，BioTek）。绘制AFC 标准曲线，并将样品读数应用于AFC 标准曲线，以获得样品孔中B pmol的AFC。样本HDAC1 活性的计算如下：HDAC1活性= 2×B / TS（pmol / min / mg = mU），其中B =标准曲线中的AFC 量，T =反应时间= 120min，S =蛋白量。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0 进行统计学分析，定量数据显示为均值±标准差（±s）。通过twoway 或 three-way ANOVA 和事后Bonferroni-Dunn检验进行比较，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠TAC 术后评估 见图1。超声心动图显示，TAC 干预前后无名和左颈动脉之间的横向收缩部位主动脉直径（图1A）。TAC 小鼠主动脉解剖图显示主动脉狭窄（图1B）。TAC 组和LGSZ + TAC组主动脉横径和血流量比较（图1D，1C），差异均无统计学意义（t=0.413，0.186，P=0.127，0.216）。

图1 小鼠TAC 术后评估

2.2 手术前后超声心动图参数比较 见表1，表2。术前和术后12 周采用无创超声心动图测量来评估心脏壁厚度的变化。与手术前相比，术后12周时TAC 组心脏左心室前壁舒张末期厚度（left ventricular anterior wall diameter，LVAWd）和舒张末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall diameter，LVPWd）的厚度增加，差异有统计学意义（P<0.05），但其他组手术前后比较，差异无统计学意义（P>0.05）。TAC+LGSZ 组手术前后LVAWd，LVPWd，射血分数（ejection fraction，EF）及缩短分数（fractional shortening，FS）比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。

表1 手术前后超声心动图参数比较（±s）

表1 手术前后超声心动图参数比较（±s）

项 目SHAM TAC TAC+LGSZ SHAM+LGSZ术前 术后12 周 术前 术后12 周 术前 术后12 周 术前 术后12 周LVAWd(mm) 0.85±0.14 0.91±0.22 0.92±0.31 1.32±0.37 0.90±0.34 1.03±0.36 0.89±0.24 0.94±0.35 LVPWd(mm) 0.91±0.26 0.98±0.32 0.94±0.35 1.30±0.28 0.93±0.29 0.99±0.37 0.93±0.27 0.92±0.31 LVIDd(mm) 3.73±0.38 3.76±0.41 3.73±0.29 4.04±0.35 3.72±0.28 3.80±0.43 3.74±0.42 3.72±0.37 EF(%) 63.48±3.15 62.91±4.54 62.00±2.82 41.37±8.79 63.01±6.77 62.24±7.25 62.25±5.34 61.05±4.73 FS(%) 37.80±3.15 35.71±2.90 38.93±4.22 21.34±4.86 38.52±5.66 36.01±4.97 38.62±5.08 36.92±6.11

表2 手术前后超声心动图参数统计学分析

2.3 SERCA2a mRNA 和SERCA2a蛋白检测结果 见图2。qPCR 和蛋白质印迹分析结果显示，TAC+LGSZ 组SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋 白表达显著高于TAC 组，差异有统计学意义（t=4.817，3.913，均P<0.05）。

图2 SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋白检测结果

2.4 各组AcH3 和AcH3K9 水平比较 见图3。TAC 组SERCA2a 的启动子元件附近的AcH3 和AcH3K9 水平低于SHAM 组，差异有统计学意义（t=2.437，2.918，P=0.024，0.013）。TAC+LGSZ组中总AcH3 和AcH3K9 与SHAM 组比较，差异无统计学意义（t=0.624，1.249，P=0.540，0.228）。

图3 各组AcH3 和AcH3K9 水平比较

2.5 各组Atp2a2 启动子附近HDAC1 酶活性和HDAC1 水平比较 见图4。TAC 组HDAC1 酶活性和HDAC1 水平均高于SHAM 组和TAC+LGSZ组，差异均有统计学意义（t=4.309，2.713，2.812，2.361，P<0.001，0.014，0.012，0.030）。

图4 各组Atp2a2 启动子附近HDAC1 酶活性和HDAC1 水平比较

2.6 各组Atp2a2 启动子区域附近GATA4 和Mef2c 水平比较 见图5。TAC 组心脏组织中，Atp2a2 启动子区域附近GATA4 和Mef2c 水平低于TAC+LGSZ 组，差异有统计学意义（t=4.816，5.007，均P<0.001）。

图5 Atp2a2 启动子区域附近GATA4 和Mef2c 水平

3 讨论

高血压、冠心病和糖尿病等损害或过度劳累心肌的疾病均可能导致心力衰竭。高血压是心力衰竭的最重要原因之一，压力超负荷会使心肌细胞承受较高的机械压力和神经激素，从而增加心肌质量并导致左心室肥大，进而发展为心力衰竭[13]。尽管多年来已经开发了多种抗心衰药物，但是在治疗该疾病方面疗效欠佳。近年来研究发现表观遗传调控在心力衰竭中起重要作用，但其具体机制尚不清楚[14]。心脏核心转录因子GATA4 和Mef2c 被证明在Atp2a2 转录的调控中发挥作用[15]。因此，本研究通过ChIP 测定Atp2a2 启动子附近转录因子结合水平。研究结果表明，TAC 组心脏组织中，Atp2a2 启动子区域附近的GATA4 和Mef2c 水平低于TAC+LGSZ 组，这可能是由于组蛋白的低乙酰化引起的。LGSZ 处理后，GATA4 和Mef2c 的结合显著增加，表明LGSZ 可逆转与Atp2a2 相关的组蛋白乙酰化作用。增加的HDAC1 活性和与编码SERCA2a（Atp2a2）基因的启动子结合，可导致组蛋白3 赖氨酸9 的低乙酰化和与该启动子区域结合的转录因子减少。进一步的研究表明，LGSZ 可以抑制HDAC1 的活性和与Atp2a2 近端启动子区域的结合，以挽救SERCA2a 的低表达并改善心脏功能。

SERCA2a 在调节心脏功能中起关键作用，其在心力衰竭中的低表达[16-17]。TAC 可诱发心力衰竭后SERCA2a 的蛋白和mRNA 水平降低。但是，这种下调SERCA2a 的潜在表观遗传机制仍不清楚。最近，一项研究表明，在慢性压力超负荷的条件下，组蛋白修饰在成人鼠左心室SERCA2a 启动子重编程基础[16]，提示组蛋白相关的表观遗传调控SERCA2a 和表观遗传学在心力衰竭病因中的潜在作用。组蛋白表观遗传修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和SUMO 化[18-19]。乙酰化是最重要的组蛋白修饰之一，可导致染色质重塑和基因表达的激活。而且，基因近端启动子附近的乙酰化不足会导致染色质紧缩，并可能影响转录因子与近端启动子关键顺式元件的结合亲和力[20]。在本研究中，我们发现，心力衰竭后，Atp2a2 启动子区域附近的总AcH3 以及亚型AcH3K9 的结合减少，活性转录因子GATA4 和Mef2c 的结合减少。但是，这种模式在AcH3K4 亚型中未观察到，表明在心力衰竭后SERCA2a 调节过程中H3 乙酰化赖氨酸位点的选择性控制。

HDAC 可从组蛋白的ε-N-乙酰赖氨酸氨基酸中除去乙酰基，使组蛋白更紧密地包裹DNA。根据与原始酵母酶的序列同源性和域结构，HDAC 可以分为四类。HDAC1 可以增强DNA 和组蛋白之间的静电吸引力，并增加染色质的紧密度，从而导致基因表达降低。抑制I 类HDAC 可抑制压力超负荷引起的心室肥大并显著改善收缩功能[14,21]，表明I 类HDAC 在心力衰竭期间起关键作用。本研究结果表明，HDAC1 的活性增加且与Atp2a2 启动子区域结合，这表明它可能是TAC 诱导的小鼠心衰期间乙酰化过低介导的SERCA2a 下调的原因。LGSZ 临床防治心力衰竭疗效确切，然而其具体机制尚不清晰，本研究发现TAC+LGSZ 组SERCA2a mRNA 和SERCA2a 蛋白表达显著高于TAC 组，提示LGSZ 可以逆转TAC 后观察到SERCA2a 的表达，同时，LGSZ 处理后乙酰化的H3 和H3K9 上调，进一步发现，LGSZ 可以抑制HDAC1 的活性和结合力。

综上，LGSZ 可以抑制HDAC1 活性，并与编码SERCA2a 基因的启动子结合，从而通过增强AcH3 和AcH3K9 与该基因近端启动子的结合而导致SERCA2a 表达增加，表明LGSZ 通过组蛋白乙酰化的修饰来上调SERCA2a 在压力超负荷引起的心力衰竭中起预防作用，可能代表了一种心力衰竭治疗的新方法。