许 颉， 金 莹， 付 坚

湖北医药学院附属人民医院临床研究所，十堰 442000

1 ERK3激酶的特性

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在细胞增殖、分化、基因表达、凋亡、代谢和运动中发挥重要作用。其基本信号传递通路遵循MAPK的三级酶促级联反应，具体包括以Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPKKK(MAPK kinase kinase)，MEK(MAP kinse-ERK kinase)作为MAPKK，ERK为MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途径。在哺乳动物中，基于其激酶结构域的同源性已经鉴定出14个MAPK[1]，分为7个MAPK模块。人们根据其亚基结构和调控特征，将MAPK分为经典MAPK和非典型MAPK。经典MAPK包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38亚型(α，β，γ和δ)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)和ERK5，其激活环中都有一个高度保守的Thr-xaa-Tyr(TXY)基序。上游激酶对这个保守TXY基序中Thr和Tyr残基的双重磷酸化导致经典MAPK被激活并转位到细胞核中[1-3]。ERK3/4，ERK7/8和NLK(Nemo-like kinase)，因不含有Thr-xaa-Tyr基序(ERK7/8除外)，不能被常规ERK激酶激活，因此属于非典型MAPK。

与经典MAPK分子相比，ERK3在其Ser-Glu-Gly(SEG)激活基序中只有一个磷酸受体位点Ser189，因此所有活化MAPK分子苏氨酸/酪氨酸双位点的MEK均不能活化ERK3；而ERK3-Ser189在静息细胞中可以逐渐磷酸化，并不受普通细胞刺激的影响[4]；此外，ERK3的亚细胞分布不受ERK3-Ser189磷酸化的影响，也不受有丝分裂或常见应激刺激的影响[5]。

2 ERK3的翻译后修饰

2.1 ERK3的核转位机制

Bind等[6]最早发现ERK3全酶由核心酶和C端延伸序列组成。ERK3 C端富含丝氨酸和苏氨酸残基的延伸序列上有高尔基体/内质网定位基序Lys-His-Leu-Asn(KHLN)，因此推测ERK3全酶定位于细胞质内。当ERK3活化进入细胞核时，其C端延伸序列发生裂解，丢失部分C端延伸序列的ERK3才得以发生核转位进入细胞核。后来证实ERK3细长的C末端延伸，由大约400个氨基酸组成，这在ERK1/2、p38亚型和JNKs中并不存在。其前150个氨基酸残基与ERK4 C末端延伸的一个区域有近50%的同源性，因此该结构域被称为ERK3和ERK4结构域(C34)中的保守区；在C34结构域之外，还有一个C末端的尾巴，它包括ERK3的最后280个氨基酸，其保守区域可能具有潜在的重要功能[7]。在ERK3激酶活性和细胞功能调节中的确切作用在很大程度上仍是未知。有研究表明，C末端延伸的翻译后修饰在细胞周期进程中调节ERK3的蛋白表达水平。此外，ERK3在激酶区的Ⅷ亚结构域以Ser-Pro-Arg(SPR)基序替代Ala-Pro-Glu(APE)，这个基序的作用与催化无关，而与C端折叠结构的稳定性有关[8]。

2.2 ERK3的磷酸化

对细胞各周期ERK3表达的分析表明，ERK3蛋白在有丝分裂细胞中积累，伴随着ERK3自主磷酸化，但这种磷酸化是可逆的，从M期到G1期转变过程ERK3又可发生去磷酸化。通过重组ERK3与有丝分裂细胞提取物的体外孵育，鉴定了位于ERK3 C末端尾部的4个残基(Ser684、Ser688、Thr698和Ser705)的磷酸化，这4个位点其中之一或多个的磷酸化可使ERK3蛋白稳定。ERK3主要的磷酸受体位点Ser189是Pak2在体外直接磷酸化的位点[9]，具有高度特异性。ERK3-Ser189磷酸化可通过自身磷酸化[6，10]发生在顺式蛋白中，也可通过Ⅰ型p21激活的蛋白激酶(Paks)反式发生[11-12]，即Ⅰ类p21激活的激酶(Pak成员)介导SEG基序的强磷酸化，导致机体中ERK3和ERK4的酶激活以及MAPK激活的蛋白激酶5(MK5)/Pak下游激活。ERK3-Ser189的磷酸化被双特异性磷酸酶2(DUSP2)降低[13]，这种作用是由ERK3羧基末端的保守公共对接结构域和DUSP2的非催化氨基末端的保守激酶相互作用基序介导的。DUSP2的表达抑制了ERK3及其下游底物MK5的激活。为了进一步研究ERK3激活位点与功能的关系，Elkhadragy等[14]针对ERK3-Ser189磷酸化位点进行了突变，使S189A不能磷酸化。S189A突变大大降低了ERK3促进肺癌细胞迁移和侵袭的能力，尽管催化失活的ERK3突变体仍然能够增加迁移和侵袭，但与野生型ERK3相比程度较小。磷酸化后的ERK3的状态，无论在血清饥饿的细胞中，还是在生长因子刺激下或者化学药物处理的细胞中都不会发生改变。ERK3的激活环磷酸化刺激了它们的内在催化活性，这是与MK5形成稳定的活性复合物所必需的，其磷酸化程度可以通过与底物MK5的相互作用间接调节[15]，但ERK3的功能与其磷酸化程度并不密切相关。

2.3 ERK3的泛素化

在处于分化的细胞中，ERK3是一个很不稳定的蛋白质，半衰期仅为30 min左右，实验表明ERK3蛋白是通过可变泛素化途径降解的。多聚泛素结合在蛋白质N端α-NH基团。第1个泛素通过其C端与ERK3游离的N端形成一个短肽，从而结合到ERK3上。其后的泛素分子相继结合在第1个泛素上，形成一条多泛素链。结合有多泛素链的ERK3可被26S蛋白酶体识别而降解。ERK3被26S蛋白酶体降解的区域有2个：一个位于ERK3的前15个氨基酸序列中；另一个则位于ERK3的第53和第82个氨基酸残基之间。由于降解区域主要位于ERK3的N端，因此如果在N端加上一段较长的序列，就可以大大延长ERK3的半衰期[1-3]。由于泛素结合发生在N末端，但受到C末端标签的影响，这可能表明ERK3的氨基和羧基末端在结构上非常接近[16]。

2.4 ERK3的羟基化

另一个调节ERK3稳定性的翻译后修饰是脯氨酸羟化酶3(PHD3)的羟基化。利用质谱分析发现，PHD3在体外能使ERK3在P25(proline 25)上羟基化，P25位点的羟基化通过保护ERK3不受蛋白酶体降解来稳定ERK3。这在细胞实验中也得到了证实：羟化酶抑制剂可促进ERK3的降解，突变体ERK3 P25A的表达水平低于野生型ERK3，并且其表达不被羟化酶抑制剂进一步抑制[17]。

3 ERK3的底物

MAPK通路是细胞内普遍存在的信号模块，细胞通过它将细胞外的化学和物理信号转化为适应性的细胞内反应。如前文所述，经典MAPK遵从经典的三级酶联反应。一旦激活，MAPK将磷酸化存在于各种亚细胞器的多种底物。ERK1/ERK2是脯氨酸导向的激酶，它能靶向磷酸化底物的丝氨酸、苏氨酸以及脯氨酸残基。到目前为止，已经鉴定出150多种ERK1/ERK2底物[18]。尽管ERK3的表达无处不在，但触发ERK3磷酸化和激活的生理刺激以及它的真实底物还没有得到充分的证实[7]，已经被证实的ERK3的底物与ERK1/2的底物存在交叉。目前被公认的ERK3底物是MK5，它是一个54 kD的丝氨酸/苏氨酸激酶，在体外可被ERK2、JNK和p38 MAPK通过磷酸化Thr-182激活[19-20]。MK5广泛表达于脑、心脏和血小板中[21-24]。MK5具有功能性的核定位信号和核输出信号，允许蛋白质在细胞核和细胞质之间穿梭。Kostenko等[25]发现，细胞核中的MK5 N端区含有催化区，而C端区是ERK3和ERK4结合所必需的[25-26]。与MK2和MK3不同，MK5属于非典型MAPK通路环节[27]。ERK3和ERK4是MK5的上游激活剂，可以诱导MK5在Thr-182处发生磷酸化[28-30]。Pak诱导的ERK3/4激活导致MK5 Thr-182位点磷酸化水平升高，激活MK5的激酶活性。Seternes等[5]发现，不论是在细胞内或是细胞外，ERK3都能被MK5特异识别。

MK5与ERK3/4形成复合物，发生活化位点Thr-182的磷酸化；而复合体中的ERK3，其C末端延伸的不同位点也会自动发生磷酸化。推测ERK3/MK5复合体参与了树突形态的调节和间隔蛋白功能的调节[31]。目前已知ERK3可与细胞周期调节因子Cdc14相互作用[32]，这在小鼠卵母细胞成熟的减数分裂过程中，对维持纺锤体稳定和中期过渡具有很重要的意义[33]。ERK3还与类固醇受体共激活因子3(SRC-3)相互作用，ERK3似乎在S857位点磷酸化SRC-3，并调节它与Ets-和SP1型转录因子的相互作用[33-34]。最近，有研究提示酪氨酰DNA磷酸二酯酶2(TDP2)为ERK3的底物，有人认为ERK3在S60位点磷酸化TDP2，并在DNA损伤反应中刺激其磷酸二酯酶活性[35]。

4 ERK3的激酶功能

4.1 ERK3的促增殖作用

虽然有迹象表明ERK3在细胞增殖中起调控作用，但确切的机制还未被阐明。功能研究表明，在P9和PC12细胞分化为神经元以及C2C12成肌细胞分化为肌管的过程中，ERK3的表达增加[36-37]，而这些细胞的分化与停止增殖有关。此外，稳定的ERK3过表达可抑制成纤维细胞进入S期。在肝细胞癌的细胞模型中，miR499a似乎通过抑制ERK3的表达来促进肝癌增殖[38]。与ERK3作为增殖抑制物的作用相反，在TCR模拟反应中ERK3似乎是内皮细胞和T细胞增殖的正调控因子[34，39]。此外，ERK3也是内皮细胞形成必需的组分，对其增殖也有一定的作用[40]。

4.2 ERK3与疾病的联系

4.2.1 ERK3与心脏疾病 有研究表明，ERK3与致心律失常性右室心肌病(ARVC)和p70S6K信号有关[41]。ERK3在培养心肌细胞中的表达受到miR-374a-5p的调控。在缺血再灌注损伤(IRI)过程中，MAPK信号通路在肝脏、肾脏、脑和心脏被激活，体外证据表明，MAPK信号通路的调节可以减少缺氧性损伤[42]。作为MAPK信号通路的一员，ERK3过表达可促进缺氧/复氧(H/R)诱导的细胞凋亡[43]。Huang等[44]研究发现，在缺血再灌注后的H9C2细胞和小鼠缺血再灌注模型中，心肌细胞miR-374a-5p的表达水平降低；将肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平作为评价心肌细胞损伤和膜完整性的敏感指标，上调miR-374a-5p后模型小鼠血清和培养心肌细胞上清液中CK和LDH释放的减少。此项研究发现miR-374a-5p的表达可能是由IRI介导的，并且可能起到保护心脏IRI的作用。ERK3是miR-374a-5p的靶向基因，miR-374a-5p可以直接与其3′-UTR结合来抑制ERK3的表达，当ERK3同时过表达时，miR-133a-5p的保护作用消失。

4.2.2 ERK3参与免疫和炎症 胸腺中T细胞的产生由复杂的生物学机制介导。胸腺的干细胞，首先分化为未成熟的CD4-CD8-双阴性(DN)胸腺细胞。这些细胞必须重排T细胞受体β(TCR-β)位点并表达前TCR(β选择)，才能分化为CD4+CD8+双阳性(DP)胸腺细胞。在胸腺细胞分化过程中，成熟的外周T细胞被T细胞受体(TCR)信号激活ERK1/2之后，可以诱导ERK3的表达，并且ERK3是由DP胸腺细胞进行正选择而表达的。在ERK3缺陷小鼠模型中，T细胞的阳性筛选率减少，DP胸腺细胞数量减半，且对体外TCR刺激的反应明显降低。Erk3+/+和Erk3-/-小鼠OT-Ⅰ和OT-OT-Ⅱ胸腺细胞体外培养24 h后存活率并没有出现差异[45]。说明ERK3在T细胞阳性筛选中起到重要的作用，但并不会影响成熟DP胸腺细胞的存活。ERK3是否有促进炎症的作用尚待研究。

4.2.3 ERK3对肿瘤形成的影响 ERK3在非小细胞肺癌、肝胆管癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中高表达，且与细胞丰度呈正比。在肝脏肿瘤细胞中发现ERK3是肝癌细胞表达最高的MAPK组分，此外调控ERK3基因的非编码RNA LncMAPK6和ERK3在肝癌干细胞中都有强烈的表达。LncMAPK6和ERK3参与了肝癌干细胞的维持调节。LncMAPK6与ERK3启动子相互作用，将RNA聚合酶Ⅱ招募到ERK3启动子上启动转录，LncMAPK6-ERK3通路也是肝脏增殖和肝肿瘤起始细胞(TIC)清除的靶点[46]。Sun等[47]的研究表明，ERK3底物MK5可能具有抗肿瘤和促肿瘤双重作用。该小组描述了MK5基因敲除小鼠更容易患7，12-二甲基苯并噻吩(DMBA)诱发的皮肤癌，推测MK5通过介导癌基因诱导的衰老来抑制皮肤癌的起始阶段。MK5在致癌RAS增殖信号中作为负调控因子，其抑制细胞增殖的能力依赖于完整的激酶活性和核定位，因为无论是丧失激酶活性的突变体还是位于细胞质中的突变体都不能阻止致癌RAS诱导的细胞增殖[48]。此外，MK5还能抑制RAS诱导的JNK活性。JNK通路与增殖有关，可以作为p53肿瘤抑制因子的负调节因子[48-49]。这些观察表明，MK5通过双重途径阻止致癌RAS诱导的细胞增殖。MK5干扰JNK途径的具体分子机制尚不清楚，在癌症中与功能的联系也尚未明确。此外，MYC蛋白可通过与MK5启动子结合并增强MK5的表达而进入负反馈循环。由于MYC是细胞周期的中心调节因子，而异常的MYC表达在肿瘤发生中起着关键作用。Kress及其同事[50]研究了MYC高表达肿瘤细胞中的MK5表达状态。其结果表明，MK5在正常结肠黏膜中的表达高于结直肠癌，而在正常结肠上皮中表达较弱，在结直肠癌组织中表达较强。

4.2.4 ERK3影响肿瘤的侵袭 ERK3增加肺癌细胞在体内外的迁移和侵袭[51]。其潜在的分子机制涉及ERK3对类固醇受体共激活因子3(SRC3)Ser857位点的磷酸化[51]。SRC3在几种类型的癌症中过表达，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌等[52]，因为它促进了细胞的增殖和转化，癌细胞的迁移和侵袭，以及小鼠的肿瘤形成和转移[53-54]，被认为是真正的癌基因。在培养细胞中，SRC3通过共同激活PEA3-和AP-1调节的MMP表达[55-58]来促进癌细胞侵袭。ERK3通过磷酸化SRC3增强基质金属蛋白酶MMP2和MMP10基因的转录[59]。MMP2和MMP10是SRC3/PEA3靶基因[59]。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP，又称IMP)属于高度保守的蛋白质家族，调节mRNAs的稳定性、定位和翻译，从而参与细胞极性形成和迁移[60-61]。IMP在各种人类癌症中过度表达，它们与片状脂质体和内陷足的形成有关，有助于转移。研究发现，敲除ERK3和SRC3后几乎消除了异种移植小鼠模型中肺癌细胞侵袭和形成肿瘤的能力。ERK3磷酸化SRC3-Ser857增加了SRC3与转录因子PEA3的相互作用，随后导致基质金属蛋白酶(MMPs)的上调，降解细胞外基质而对细胞侵袭发挥至关重要的作用[62]。

ERK3在多数瘤细胞中具有促进肿瘤侵袭的作用，主要通过以下3个方面：①通过磷酸化SCR3和上调SCR3介导的MMPs基因表达，改变肿瘤细胞的粘附性及形状，使肿瘤细胞接触面积变小，肌动蛋白细胞骨架重排加快肿瘤细胞的侵袭速度。②通过MK5刺激血管生成来支持肿瘤的生长和进展。MK5介导血管内皮生长因子(VEGF)反应，促使内皮细胞迁移。VEGF主要与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，通过p38 MAPK亚型α和β的级联反应触发MK5 Thr-182位点磷酸化[63]。已经证实p38 MAPK通路激活VEGF可诱导HSP27的磷酸化，并刺激内皮细胞的肌动蛋白重组和迁移[64]。③ERK3在上皮结构的建立和维持中起到至关重要作用，在人类上皮性乳腺癌细胞中，抑制ERK3的表达会导致上皮细胞增厚，并伴有异常的粘附和紧密连接。转录因子AP-2α(TFAP2A)是上皮基因表达的重要转录调控因子，参与ERK3依赖性基因表达的改变。ERK3是完全激活TFAP2A依赖的转录所必需的，而上皮结构的损伤是癌症进展和转移的标志。当敲除人乳腺上皮癌细胞系MCF7中ERK3基因时，上皮细胞的结构会发生改变，其连接功能也会受到破坏[40]。

4.2.5 ERK3的抑瘤作用 Chen等[65]在黑色素瘤中观察到BRAF(B-Raf proto-oncogene)，一种致癌的Ser/Thr激酶，通过增加ERK3信使RNA水平和蛋白质稳定性来上调ERK3表达水平。尽管上调ERK3基因转录需要BRAF的激酶活性，但BRAF以一种非激酶依赖的方式稳定了ERK3蛋白，证明ERK3可以抑制黑色素瘤细胞的迁移、增殖和集落形成；同时，高水平的ERK3与黑色素瘤患者存活率增加相关。这些结果表明ERK3是黑素瘤细胞生长和侵袭性的有效抑制因子。MK5介导FOXO3a的Ser-215位点磷酸化，进而上调miR34b/c水平，miR-34b/c与c-myc mRNA结合导致c-myc蛋白水平降低[66]。myc蛋白通过与MK5启动子结合又可增强MK5的表达，进而进入负反馈循环。MK5还能抑制RAS诱导的JNK活性。JNK通路与增殖有关，可以作为p53肿瘤抑制因子的负调节因子，研究表明MK5通过双重途径阻止致癌RAS诱导的细胞增殖。Kostenko等[67]推测MK5还可通过介导癌基因诱导的衰老来抑制皮肤癌的起始阶段。这些令人兴奋的发现均表明MK5具有肿瘤抑制功能。

不论是ERK3直接作用还是ERK3-MK5通路，似乎对某些肿瘤都发挥着抑制作用。可能是因为ERK3-MK5可作用于Ras/Raf通路的下游或参与c-myc表达的调节。Ras、Raf和c-myc基因是癌症中最常见的突变基因，目前尚缺乏有效的Ras和c-myc抑制剂。ERK3和MK5将成为研制Ras、Raf或c-myc活性受到干扰的肿瘤治疗药物的突破点。

4.3 ERK3其他功能

近期，Takahashi等[40]在脊椎动物中发现，敲除胚胎表皮上皮细胞中ERK3基因破坏了上皮细胞中粘附和紧密连接蛋白的分布，以及紧密连接屏障功能，导致表皮破裂。此外，在人类上皮性乳腺癌细胞中，抑制ERK3的表达会导致上皮细胞增厚，并伴有异常的粘附和紧密连接。此外，ERK3/MK5通路的一个下游靶点，即转录因子FOXO1，它可以促进主要脂解酶甘油三酯脂酶(ATGL)的表达[68]。这是首次发现ERK3/MK5通路在能量代谢中发挥调控功能。

5 小结与展望

在肿瘤疾病模型中ERK3可被LncRNA调控，且ERK3在肿瘤的发生和侵袭中处于核心地位。因此，ERK3可能成为肿瘤相关性疾病治疗的新靶点。然而现有研究还未阐明ERK3抑制或促进肿瘤迁移及增殖的分子机制。目前也没有一种特异性的靶向药物针对ERK3通路对肿瘤的发生及发展进行干预。虽然已有研究表明联合运用二甲双胍和三氧化二砷化疗能够促进肝内胆管癌细胞ERK3表达，抑制肿瘤细胞增生，促进其凋亡，但此研究并未证明此效应是否由ERK3直接作用或间接作用所引起[69]。此外ERK3在细胞和组织中广泛表达，特异性提高或降低其表达水平所引起的生物学效应有待进一步研究证实。相信在今后随着人们对ERK3更深入的研究，ERK3通路在体内的作用机制将会被更清楚地阐释，从而在疾病的预防和治疗过程中发挥更大的作用。