顾小晶，吴秋燕，黄玉宇

（苏州市中医医院，江苏 苏州 215000）

中药汤剂是指将中药饮片或粗颗粒加水煎煮或用沸水浸泡后，去渣取汁而得到的液体制剂。中药汤剂在临床上使用广泛，充分适应中医辨证论治、随证加减的原则。由于患者自行煎煮中药汤剂较麻烦，故很多患者选择在医院代煎中药。目前，我国尚未建立全面的中药汤剂机器煎煮技术规范和标准体系，具体的煎煮规范仍由各家医院自主制定。因此，本文中我们选用牡蛎散作为代表方剂，采用YJD 型“十功能自动煎药机”（该系列煎药机能满足《医疗机构中药煎药室管理规范》中关于中药煎煮的要求），开展中药汤剂专业煎煮方面的相关研究。牡蛎散出自宋代陈师文所著《太平惠民和剂局方·卷之八治杂病》一书中，由牡蛎、黄芪、浮小麦、麻黄根四味药材组成，具有固表止汗、益气敛阴的功效[1]。牡蛎散是固涩剂的代表方之一。本试验以牡蛎散煎剂中浸出物、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及碳酸钙的含量为综合性评价指标，通过单因素试验和正交试验确定采用煎药机煎煮牡蛎散的最佳工艺，为制定标准的中药汤剂机器煎煮规范提供依据。

1 材料与试药

YJD-20GL 型十功能自动煎药机（由北京东华原医疗设备有限责任公司生产），Shimadzu LC-20AB 高效液相色谱系统（由日本岛津公司生产），RE-52 旋转蒸发仪（由瑞士BUCHI 公司生产）。毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品（批号为20633-67-4，由中国药品生物制品检定所提供），高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）级乙腈、磷酸、乙醇、甲醇为分析纯。本试验所用的牡蛎、黄芪、麻黄根、浮小麦饮片均购自苏州天灵中药饮片有限公司，并经我院国家中药传承人沈多荣主任中药师鉴定确认其品质合格。

2 方法与结果

2.1 牡蛎散中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：YMC-Pack c4 （250 mm×4.6 mm，5 μm）（YMC Co. Ltd，Japan）；流动相：乙腈（B）-0.1%磷酸水（A）溶液，梯度系统0 ～20 min，20%～40%B；20 ～25 min，40%～20%B；流速：1 mL/min；检测波长：315 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL[2-3]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品及供试品溶液的色谱图（检测方法为HPLC法）见图1。

图1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品溶液及供试品溶液的HPLC 色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品8.3200 mg，置于10 mL 的容量瓶中，加入适量甲醇溶解、定容至刻度，配置成0.8320 mg/mL 的标准品溶液，置于4 ℃的冰箱中存放备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取100 mL 的牡蛎散汤剂溶液，加入60 mL 的乙醇，混合均匀后置于4 ℃的冰箱中静置24 h。24 h 后对液体进行滤过，蒸干滤液，用甲醇超声溶解残渣，定容至100 mL 的容量瓶中，将其作为供试品溶液，并置于4 ℃的冰箱中存放备用。

2.1.4 方法学考察 1）标准曲线的绘制。分别精密量取“2.1.2 项”下 的 对 照 品 溶 液2 mL、1.5 mL、l mL、0.5 mL、0.3 mL，置 于5 mL 的 容 量 瓶 中，加 入 甲 醇定容至刻度，摇匀后按上述色谱条件进行测定。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程Y=7498699X-153955，R2=0.9994。这表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.04992 ～0.3328 mg/mL 的范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。2）精密度试验。精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品溶液10 μL，重复进样6次（测定方法及色谱条件同上），计算得到样品中毛蕊

异黄酮葡萄糖苷含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.98%。这表明，该检测方法的精密度良好。3）稳定性试验。精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、16 h、24 h 进样测定（测定方法及色谱条件同上），计算得到样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD 为2.98%。这表明，供试品溶液在24 h 内的稳定性良好。4）重复性试验。取同一批号样品6 份，按上述供试品溶液的制备方法制备成6 份供试品液，分别进样10 μL 进行测定（测定方法及色谱条件同上），计算得到样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD 为2.10%。这表明，该样品的重复性很好。5）加样回收率试验。称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷一半处方量的组方饮片进行煎煮，加入牡蛎散处方量一半的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，按上述样品制备方法制备牡蛎散样品溶液6 份。精密吸取各样品溶液10 μL 进样测定（测定方法及色谱条件同上），计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为96.98%，RSD 为1.27%。

2.2 牡蛎散中碳酸钙含量的测定方法

精密称取牡蛎散汤剂溶液50 mL，加入50 mL 的无水乙醇进行醇沉处理，放置一夜后精密量取上清液25 mL。先后在上清液中加入10% 的三乙醇胺10 mL、水50 mL，用1 mol/L 的氢氧化钠（sodium hydroxide，NaOH）将上清液的酸碱度（potential of hydrogen，pH）调至13（显黄色）。之后在其中加入少量的钙黄绿素指示剂，并用0.05 mol/L的乙二胺四醋酸二钠滴定液滴定至溶液中黄绿色荧光消失并显示橙色。计算供试品中碳酸钙的含量。

2.3 牡蛎散中浸出物含量的测定方法

按《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中规定的浸出物测定法[4]，用干燥的滤器滤过牡蛎散水煎液，精密量取25 mL 的滤液，置于干燥至恒重的蒸发皿中。对滤液进行水浴后蒸干，于105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷却30 min 后进行称量，用减量法计算浸出物的含量。

2.4 煎煮工艺的单因素考察

2.4.1 煎煮工艺对牡蛎散中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响 为筛选蛎散最佳的机器煎煮工艺，在查阅中药煎煮相关文献[5-8]的基础上进行单因素考察，以牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量为考察指标。

2.4.2 浸泡时间对牡蛎散中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响 取煅牡蛎120 g、黄芪120 g、麻黄根27 g、浮小麦240 g，加水3500 mL，分别浸泡0 min、10 min、20 min、30 min、40 min。煎煮20 min 后进行滤过处理，并定容至2000 mL。测量各煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量。结果显示，随着浸泡时间的增加，煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量都呈先升后降、再升再降的趋势；在浸泡30 min 的情况下，检测出上述三种成分的含量最高。见图2。因此本试验选取浸泡20 min、30 min、40 min这三个浸泡时间进行正交试验考察。

图2 不同浸泡时间对牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响

2.4.3 煎煮时间对牡蛎散中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响 在其他煎煮条件不变的情况下，考察分别煎煮10 min、15 min、20 min、25 min、30 min时牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量。结果显示，随着煎煮时间的增加，牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量基本呈升高趋势。见图3。考虑实际生产时间、成本等因素，本试验选取煎煮20 min、25 min、30 min 这三个煎煮时间进行正交试验考察。

图3 不同煎煮时间对牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响

2.4.4 煎煮温度对牡蛎散中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响 在其他煎煮条件不变的情况下，分别考察煎煮温度为105℃、110℃、115℃、120 ℃时牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量。

结果显示，随着煎煮温度的增加，牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量基本呈降低趋势。见图4。故本试验选取105 ℃、110℃、115 ℃这三个煎煮温度进行正交试验考察。

图4 不同煎煮温度对牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物含量的影响

2.5 煎药机煎煮工艺的正交试验设计及结果

依据单因素考察结果，以牡蛎散水煎液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量为指标，进行三因素三水平正交试验（L9）[5-8]：A 为浸泡时间（20 min、30 min、40 min），B 为煎煮时间（20 min、25 min、30 min），C 为煎煮温度（105 ℃、110 ℃、115 ℃）。根据“2.1.3 项”制备正交试验中的9 组供试品溶液，并分别测定其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、碳酸钙及浸出物的含量。本试验选择综合加权评分法对试验结果进行方差分析，加权评分=（浸出物含量/ 样品中最高浸出物含量）×50+（毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率/ 样品中最高毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率）×30+（碳酸钙含量/ 样品中最高碳酸钙含量）×20。将计算得到的总分带入正交试验中，结果如表1 所示。可见，各因素对牡蛎散机器煎煮工艺的影响从小到大依次为C ＜A ＜B，即煎煮温度＜浸泡时间＜煎煮时间。故浸泡时间、煎煮时间对牡蛎散机器煎煮工艺的影响较大，考虑可能与“牡蛎质体重坠”有关。用SPSS 15.0 统计学软件对以上结果进行方差分析表明，煎煮时间因素的F值为23.46，P值为0.0409。故煎煮时间对牡蛎散的机器煎煮工艺有显著性影响。详见表2。按照临床煎药的可行性，并综合正交试验的结果和方差分析，确定牡蛎散的最佳机器煎煮工艺为A3B3C2，即将牡蛎散饮片浸泡40 min 后，用煎药机在110 ℃的条件下煎煮30 min。

表1 牡蛎散机器煎煮工艺正交试验表及结果

表2 牡蛎散机器煎煮工艺试验的方差分析表

2.6 验证试验

称取牡蛎散处方量饮片，按照最佳的机器煎煮工艺进行3 次验证试验，并与传统煎煮工艺进行比较。传统的砂锅煎煮法是：称取煅牡蛎120 g、黄芪120 g、麻黄根27 g、浮小麦240 g，加水3500 mL，浸泡40 min 后先用武火加热，待水沸腾后改用文火煎煮30 min。30 min 将煎液滤出，定容至2000 mL，即得到传统工艺煎煮汤剂。测定传统工艺煎煮汤剂中浸出物、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及碳酸钙的含量。结果显示，与采用传统砂锅煎煮法相比，采用机器煎煮法（按最佳机器煎煮工艺进行煎煮）进行煎煮时牡蛎散煎剂中浸出物、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和碳酸钙的含量均更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。在最佳机器煎煮工艺条件下，牡蛎散煎剂中浸出物、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和碳酸钙的含量均高于正交试验中9 个试验的结果，且RSD均在3%以内。这表明，本试验筛选出的机器煎煮工艺稳定、合理、可靠。

表3 不同煎煮方法下牡蛎散煎剂中浸出物、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及碳酸钙的含量

3 讨论

中医在使用中药饮片时必须掌握正确的煎煮方法，中药饮片煎煮的好坏会直接影响其药效及患者的疗效。李时珍在《本草纲目》中说：“凡服汤药，虽品物专精，修治如法，而煎煮者鲁莽造次，水火不良，火候失度，则药亦无功[9]。”因此，要使中药汤剂发挥最大的功效，必须严格掌握其煎煮工艺。在牡蛎散中，黄芪、牡蛎为核心药对，其在牡蛎散及其类方中是密不可分的，发挥着重要的治疗作用[1]。黄芪中的主要药物活性成分为毛蕊异黄酮葡萄糖苷（黄酮苷类），因此本试验将该成分的含量作为考察指标之一。牡蛎较为特殊，既是动物药，又需要先煎，符合本试验对不同类型方剂、不同种类和不同药用部位中药饮片及不同类型有效成分的选择原则。本试验将牡蛎中所含的碳酸钙（无机盐类）作为另一个指标进行考察，最后结合浸出物含量进行研究。从本试验的结果可以看出，影响牡蛎散机器煎煮工艺的因素依次是煎煮时间、浸泡时间、煎煮温度。煎煮时间是影响牡蛎散机器煎煮工艺的主要因素，且机器煎煮法明显优于传统的砂锅煎煮法。

本试验筛选出的用煎药机煎煮牡蛎散的最佳工艺为：将牡蛎散饮片浸泡40 min 后，用煎药机在温度为110 ℃的条件下煎煮30 min。该结果不仅能为牡蛎散及此类中药方剂的机器煎煮提供参考标准和质量保障，还可为本院的中药代煎工艺提供一定的依据。