玻璃基介电型MALDI-TOF MS一次性靶片设计制备及其在微生物检测性能的研究

2021-12-06卢瀚仑刘宁炀

质谱学报 2021年6期

卢瀚仑，刘宁炀

(广东省科学院半导体研究所，广东广州 510650)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)近年来广泛应用于生物质检测[1]，应用范围涵盖核酸[2-4]、多肽蛋白质[5-7]、细菌和微生物分析[8-11]、抗体[12-13]、药物科学[14-15]等方向。

靶片是MALDI-TOF MS中用以承载基质和检测物，同时为检测物提供均匀解吸电位的重要装置。靶片的结构设计、材料选择以及加工工艺对质谱测试性能有较大影响。目前已商品化的用于医疗检测领域的多为重复使用的不锈钢靶片。受钢表面特殊亲疏水工艺等加工成本的限制，其价格偏高。同时，由于多次使用的特性，不利于实现临床使用的高洁净度[16]、少交叉污染[17]、测试结果可靠[18]等特殊要求；且长期接触清洗靶片的有机溶剂(如丙酮、乙腈、乙醇等)会对人体产生危害[19]，如果清洗不到位，还会直接影响测试结果，增加误诊率。因此，一次性靶片的研发与生产是MALDI-TOF MS用于临床诊断的技术瓶颈。 Schürenberg等[20]开发的一次性塑料靶片得到了一些应用，但存在塑料衬底在激光作用下降解而导致测试结果不准确的问题。因此，本团队拟开发一种玻璃衬底、靶点为金属金表面、含有特殊结构的介电型一次性靶片。该靶片与钢靶片相比具有的优势为：1) 三维点样结构有利于手动点样的精准性；2) 特殊结构设计使结晶均匀性更好，提升分辨率；3) 材质以玻璃为主，成本低廉。该靶片与塑料靶片相比具有的优势为：1) 耐高温，可进行高温灭菌处理；2) 不易吸附大气中的杂菌成分而造成污染；3) 全无机结构，不易被激光损坏导致测试物污染。本文将首先研究影响玻璃靶片生产的主要工艺问题，从玻璃选材、刻蚀工艺的优化、镀金结构的设计，解决生产过程中遇到的样品无法正常电离、玻璃底面出现结晶等问题，得到符合技术参数要求的靶片。然后分别从基质结晶情况、测试质量稳定性分辨率以及细菌标准品测试稳定性等方面，对比其与钢靶片的性能。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

CMI-1600基质辅助激光解吸电离质谱仪：广州禾信公司产品；DE400DHL电子束蒸发镀膜系统：北京德仪公司产品；ABM/6/350/NUV/DCCD/BSV/SA紫外光刻机：美国ABM公司产品。

1.2 样品与试剂

α-氰基-4-羟基肉桂酸(C8982,α-CHCA)、0.1%三氟乙酸(302031,TFA)、乙腈(34851,ACN)，促肾上腺皮质激素18-39(A8346,ACTH Fragment 18-39)、胰岛素(91077C,Insulint)、肌红蛋白(M1882,Myoglobin)、牛血清白蛋白(B2064,BSA)：美国Sigma-Aldrich公司产品；丙酮、异丙醇、氟化铵腐蚀液BOE(6∶1)：均为MOS级，江阴市化学试剂厂有限公司产品；AZ4620、AZ2035光刻胶，AZ300MIF显影液：汶颢股份有限公司产品。所有化学试剂使用时均未进行二次纯化操作。质谱仪校正物Peptide Calibration Standard I(#206195)和Protein Calibration Standard I(#206355)：德国布鲁克道尔顿公司产品。实验纯净水：由Milli-Q Reference超纯水系统生产；750 μm B270玻璃：肖特玻璃公司产品；750 μm浮法钠钙玻璃：洛阳玻璃厂产品；超纯金属：中诺先进材料(北京)有限公司产品。

测试样品：ATCC-8739 大肠杆菌标准溶液、标准蛋白和ACTH多肽样品。基质为α-CHCA的乙腈-三氟乙酸-水(50∶2.5∶47.5,V/V/V)饱和溶液。根据各药品所需浓度，利用0.1% 三氟乙酸溶液配制而成。采用覆盖点样法，先点1.0 μL样品，然后覆盖1.0 μL基质，自然风干后上机测试。

MALDI-TOF MS使用CMI-1600进行测试。正离子模式，离子加速电压22 kV，使用波长343 nm、脉宽1 ns、重复频率2 kHz的激光进行电离。由200次激光脉冲后叠加得到质谱结果，使用标准蛋白混合物Protein Calibration Standard I和标准肽混合物Peptide Calibration Standard I校准质谱仪。

1.3 玻璃衬底介电型一次性靶片的制备

为降低一次性使用成本，减少靶片的点数，形成了28点小样量靶片的设计，示于图1a。根据用户以往使用体验，本靶片在载样区特别设计了凹坑结构，方便手动点样时液滴不容易溢出点样区，同时可增加载样体积，以获得更好的测试效果。靶片实物照片示于图1b。

图1 玻璃基靶片的设计与实现Fig.1 Design and fabrication of the glass based target plate

靶片的加工工艺示于图1c：1) 依据图1a制作玻璃铬光刻掩膜；2) 将所需玻璃衬底用激光切割成19.7 mm × 30.0 mm，并实施AZ4620背胶保护，正面AZ2035掩膜曝光显影样品区图形，形成中间体；3) 将中间体置于BOE腐蚀液湿法腐蚀一段时间，用去离子水彻底清洗，以阻止继续被刻蚀，得到结构衬底，105 ℃ 烘干5 min，备用；4) 使用电子束蒸发台，在不去掉掩膜胶的情况下进行电子束蒸镀金属，正面样品区为20 nm Ni-V合金与200 nm Au；5) 背面去胶后，电子束蒸镀20 nm Ni-V合金；6) 使用丙酮超声波辅助去除并回收残胶和多余金属，分别用异丙醇、纯净水完全清洁后，高纯氮气吹扫5 min，105 ℃ 烘干5 min，即得样品靶片。

2 结果与讨论

2.1 背面镀镍的影响

为降低成本，本课题组先前的设计没有对玻璃背面进行全面镀镍。样品制备完成后上机测试，发现靶托一些位置的样品点均无法发生有效电离，导致质谱测试失败。随后开发了背面全面镀镍的方案，成功解决了这一问题。为理解背面不镀镍造成样品电离失败的原因，使用COMSOL建模对靶托附近的电场分布进行有限元计算，结果示于图2。

图2 初级加速极靴在2 cm(a)和0 cm(b)时的电场分布Fig.2 Electric field distributions from the target holder to the primary acceleration shoe at 2 cm (a), 0 cm (b)

背面不镀金时靶片的衬底是绝缘玻璃，而靶托是通电的不锈钢金属材质。因此，在背面不镀金时，靶片正面载样区的金表面电荷来源于靶托给玻璃的极化。而由有限元仿真结果可知，不同的极靴中心在靶托的凹槽结构产生了较明显的电场变化，这一变化直接通过玻璃非良好接触传递给靶板样点。由于玻璃不是均匀介电体，并且与靶托接触电阻不可控，电场结构误差会被放大，最终导致样品靶片不同位置的电场强度差异过大而电离失败。如果在靶片背面实施镀镍与玻璃紧密接触，减少靶片与靶托的接触不良，有利于电场变化均匀化，从而解决无法电离样品的问题。

2.2 靶片衬底材料选择对刻蚀的影响

本实验分别使用B270玻璃和浮法钠钙玻璃进行加工测试，按照前述规则进行光刻掩膜，并用氢氟酸-氟化铵(6∶1)的BOE刻蚀5 min，最后上镜检测。结果表明，BOE对2种玻璃的刻蚀速度相似，均约为1.0～1.3 μm/min。

经过BOE刻蚀后的B270玻璃底面出现了明显的纹理结构，表面不光滑，示于图3a；刻蚀后B270玻璃底面局部影像示于图3b，可看出使用B270光学玻璃虽然有更好的澄清度，但刻蚀底部出现了较多的晶体结构；从图3c可以看出，在光刻掩膜下，BOE对玻璃区域的纵向刻蚀深度约为6.3 μm，对边沿的侧向过刻蚀接近0.01 mm，过刻蚀比率约为2∶1，这与BOE刻蚀硅的性质接近[21]。由于实验设计的靶点直径为2.65 mm，侧向过刻蚀对尺寸不准确度仅贡献约3.8‰，可以认为完全不影响图形的准确度。在2.65 mm直径下，6～7 μm深度的凹槽足以容纳约20 μL的极限溶液体积，故这一形貌对于实验需要的靶片参数来说是可取的。苏打玻璃刻蚀后的底面光学影像示于图3d，比图3b显示出更光滑均匀的底面结构，表面没有产生结晶状的颗粒，显现出良好的形貌特征。从刻蚀后形貌可知，苏打玻璃是此工艺路线中比较合理的衬底材料。通过查阅玻璃数据手册发现，普通浮法钠钙玻璃的铝含量小于1%，而B270含有的铝成分更多(约2%～3%)，由此推测底面不平整现象是因为BOE中氟离子与玻璃中过多的氧化铝发生化学反应生成难溶的三氟化铝结晶，阻止了均匀刻蚀。因此，实验最终选用浮法钠钙玻璃为玻璃衬底材料，成功制备了形貌可控，满足测试需求的玻璃靶片。

图3 SEM(a)和光学显微镜(b)拍摄B270玻璃腐蚀后底面，SEM拍摄苏打玻璃刻蚀后底面与光刻胶关系(c)，光学显微镜拍摄苏打玻璃刻蚀后结果(d)Fig.3 Bottom surfaces of B270 glass after etching taken by SEM (a) and optical microscope (b), relationship between the bottom surface and photoresist of soda glass after etching taken by SEM (c), optical image taken after etching of soda glass (d)

2.3 结晶情况对比

针对上述制备成功的玻璃靶片，分别取1 μL CHCA基质溶液滴于钢靶片和玻璃靶片载样区，自然风干，放入MALDI-TOF MS载样平台，通过CCD摄像头相同放大倍率下观测靶点结晶状态。钢靶片和玻璃靶片的结晶形貌示于图4。对比可知，玻璃靶片拥有更佳的结晶均匀度、更小的结晶粒径，由于MALDI-TOF MS是对样品区域不同位置进行随机采样并累加而获得质谱数据，因而更加平整的结晶效果测试结果更优。

2.4 质荷比准确度

同等点样条件下，对比了28个采样点下ATCC-8739的质谱测试。以m/z4 365为基准进行测试，结果示于图5a。从图中散点分布可以看出，玻璃靶片与钢靶片的离散程度基本一致。值得注意的是，钢靶片在A2和B3没有出现这个峰，表现出重大缺陷，在计算平均值和标准差时，排除了这2个异常点。计算结果表明，玻璃靶片在该峰各点表现为m/z4 365.24±0.69，而钢靶片的表现为m/z4 365.79±0.75。对比数据可知，如果排除异常点的干扰，2种靶片在m/z4 365 处表现相同。

为进一步验证测试质荷比的准确度，以特征m/z5 381进行相同实验，示于图5b。玻璃靶片与钢靶片的离散程度基本一致。同样，钢靶片在A2与B3出现了异常，可能是点样问题引起的，因此排除了这一干扰点。经计算得到，玻璃靶片表现为m/z5 381.88±1.2，而钢靶片为m/z5 382.02±0.95。综上，可认为玻璃靶片与钢靶片的质量数准确度处于同等水平。

图4 钢靶片(a)和玻璃靶片(b)的结晶形貌Fig.4 Crystal morphology of steel target (a) and glass target (b)

图5 玻璃靶片与钢靶片的测试质荷比对比特征m/z 4 365(a)和m/z 5 381(b)Fig.5 Mass-to-charge ratios comparison of glass target and steel target at m/z 4 365 (a) and m/z 5 381 (b)

2.5 分辨率

2.5.1单谱分辨率分别以ATCH与混合蛋白质为模式物进行打单谱对比分辨率，示于图6。玻璃靶片在ACTH主峰m/z2 466、2 467、2 468上的分辨率与钢靶片基本一致，但玻璃靶片在高分子质量区显示出更明确的细节，具体表现为m/z2 469、2 470以及2 471的峰值信号与m/z2 467相对强度比钢靶片更大，这有利于建立在基准物吻合度检验的细菌图谱的机器验证。

从图6b可以看出，在m/z10 000 以前，混合蛋白质的谱图分辨率在玻璃靶片与钢靶片上表现一致；在大于m/z10 000的区域，即m/z12 373与m/z16 969峰的分辨率上，玻璃靶片的分辨率比钢靶片高约16%。这可能是因为在大分子质量段，玻璃靶片的电容电场均化效应使其动能平均化作用更明显，体现了玻璃靶片检测大分子质量蛋白质的优势。

2.5.2分辨率综合对比使用大肠杆菌ATCC-8739进行分辨率综合对比，示于图7。玻璃靶片与钢靶片在分辨率上的离散规律相似，程度接近。经计算得到，玻璃靶片对特征m/z4 365的分辨率为746.38±59，而钢靶片为712.91±81。对特征m/z5 381，玻璃靶片的分辨率为871.94±75，钢靶片为833.84±90。从以上可看出，玻璃靶片具有更好的分辨率以及更窄的分辨率波动性，可能是因为玻璃靶片具有更好的结晶稳定性。同时，使用光刻工艺可实现每个样品点高度的均一化，进一步提升其分辨率。由于靶片特殊的电容型结构，带来了脉冲引出离子时较大的靶片电容造成的动能均化效应。

a,c.玻璃靶片；b,d.钢靶片图6 ACTH(a,b)和混合蛋白质(c,d)测试分辨率对比图Fig.6 Comparison of resolution in testing proteins ACTH (a, b) and mixed proteins (c, d)

2.6 信噪比

2.6.2信噪比对比使用ATCC-8739大肠杆菌进行信噪比对比，示于图9。可以看出，玻璃靶片在m/z4 365和m/z5 381均表现出更高的信噪比趋势。玻璃靶片在m/z4 365的信噪比是223.07±119，钢靶片是146.89±105；玻璃靶片在m/z5 381的信噪比是245.58±126，而钢靶片是148.99±93。综上，玻璃靶片的分辨率优于钢靶片60%以上，但分辨率稳定性没有显著差异。

2.7 细菌指纹图谱评分测试

通过软件程序对玻璃靶片与钢靶片进行ATCC-8739标准细菌指纹图谱评分测试。软件评分原理是将测试的细菌质谱图与细菌数据库中标准谱进行差分比对后，根据相似度进行评分，评分从0～10分表示相似的可信度从低到高，满分为10，计算结果列于表1。可知，玻璃靶片的总体汇总评分为9.98±0.022，而钢靶片为9.76±0.92，表明玻璃靶片具有更优秀的细菌鉴定性能。

3 结论

本研究设计了一种玻璃衬底的介电型一次性MALDI-TOF MS靶片。通过优化工艺路线和衬底选择，成功制备了满足技术要求的玻璃靶片。测试数据表明，玻璃靶片在质量数测试稳定性和精确度方面与常用的钢靶片持平，但分辨率、信噪比以及细菌指纹图谱测试评分等技术指标均优于传统钢靶片。由于该靶片使用了廉价易得的浮法钠钙玻璃为衬底，且工艺简单，在未来的批量生产过程中(10万片/批次)，有望将平均材料成本控制在10元/片，从而进一步降低测试成本并提高性能，提升配套MALDI-TOF MS作为临床医疗诊断领域解决方案的使用价值。