王超敏，李雅茹，魏莎莎，郎繁繁，周景丽，陈旭峰，许 女，*

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.食醋发酵科学与工程山西省重点实验室，山西 太原 030400；3.山西紫林醋业股份有限公司，山西 太原 030400）

传统的山西老陈醋由独特的混菌固态发酵工艺生产，独特的酿造微环境形成独特稳定的微生物发酵菌群，并赋予山西老陈醋独特的口感与风味。山西老陈醋主体酸（醋酸）是由醋酸菌（acetic acid bacteria）产生的[1]。其中，巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）是醋酸发酵阶段的主要优势产酸菌，还具有产乙偶姻、川芎嗪等风味物质和功能活性物质的能力[2-4]。具备高温、酒精、酸等耐受特性及高产酸、产乙偶姻一直是食醋产业选育醋酸菌菌种的目标方向。查婧等[5]从福建传统红曲醋中分离出一株产酸能力强的醋酸菌株，并鉴定为斯氏葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter swingsii）；梁丛颖等[6]采用传统分离培养与16S rRNA基因序列分析相结合的方法从诺丽自然发酵汁中分离鉴定出24株醋酸菌，并筛选出一株发酵性能和耐受特性均良好的热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）；刘阳等[7]从保宁醋醋曲中筛选获得醋酸杆菌（Acetobacter sicerae）A11，其产酸量为30.90 g/L；张烨等[8]从清徐醋厂的醋醅中分离得到5株产酸能力强的醋酸菌，其中醋酸菌F20可耐受体积分数13%的乙醇，醋酸菌F6可耐受高温，在35 ℃高温条件下产酸量达4.964 g/100 mL；吴越等[9]从杏皮渣醋中分离筛选出6株醋酸菌，醋化醋杆菌Ac02的醋酸产量最高（3.04 g/100 mL）。

目前，随着现代菌株分子分型手段的发展，肠杆菌基因间保守重复序列（Enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）、随机扩增多态性脱氧核糖核酸（random amplified polymorphic deoxyribonucleic acid，RAPD）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等已被成功用于牛乳[10]、泡菜[11]、肉品[12]、黄酒[13]中大肠杆菌、芽孢菌、沙门氏菌、酵母菌菌株、醋酸菌菌株[14-15]的分型，使人们对于微生物种群结构特征、微生物多样性、发酵规律等有了更加深入的了解。ERIC-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术为利用ERIC序列中高度保守区来设计一对反向引物，进行PCR扩增，可根据所得到的扩增产物电泳条带来区分细菌的株（型），相比于其他分型手段，其具有成本较低、操作技术简单等特点。金莉莉等[16]用ERIC-PCR技术鉴定李斯特氏菌，与国标生化方法检测结果完全一致，该技术可用于李斯特氏菌种、菌株的鉴定以及进一步分型研究；苏战强等[17]对27株新疆牛源大肠杆菌O157：H7分离鉴定及ERIC-PCR基因分型，27株分离菌有8种类型：A型有2株，B型是优势菌、有10株，C型有3株，D型有8株，剩余菌株为分散型分布，有4种型；苏俊霞[2]从镇江香醋醋醅中分离出75株醋酸菌，分为三个型别：Ⅰ型有63个菌株，Ⅱ型有7个菌株，Ⅲ型有7个菌株。

目前，鲜有关于山西老陈醋来源醋酸菌菌株分型及型别与发酵特性关系研究。因此，本研究采用传统培养分离方法从山西老陈醋醋醅中分离筛选醋酸菌，通过形态学观察，结合分子生物学鉴定其种属，同时进行ERIC-PCR分型，并研究其生长耐受性和产酸、产乙偶姻特性，旨在揭示山西老陈醋醋发酵菌群的特征、分型与性状关系，从中筛选出优良菌株，以期将来开发成直投式发酵剂强化应用于山西老陈醋酿造中，达到提质增效的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

醋醅：采集山西紫林醋业股份有限公司老陈醋醋酸发酵过程中的醋醅，发酵15 d，每隔1 d进行多点采样，样品装入自封袋，取回后立即进行微生物分离。

1.1.2 试剂

细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京博迈德基因科技有限公司；PCR引物：由深圳华大基因公司合成；DNA Maker、MIX：生物工程（上海）有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

醋酸菌液体培养基[18]：1%酵母浸膏，2%葡萄糖，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min后加入1%无菌碳酸钙和4%无水乙醇。固体培养基中加入2%琼脂。

1.2 仪器与设备

T100型PCR仪、Universial Hood Ⅱ型凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪：北京六一仪器厂；PHS-3C型pH计：上海佑科仪器仪表有限公司；YXQ-LS-50S11型多功能摇床：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；722型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

从泉州志愿服务开展的情况看，大部分志愿活动是由政府部分机构组织的，志愿者也是由政府机关工作人员组成。政府主导和行政推动的方式虽然有利于启动志愿服务活动，但过分依靠行政推动往往会出现“被志愿”或志愿服务形式化或运动化的问题。[7]由于长期的行政化主导，一方面让民众产生误解，以为志愿服务是政府行为；一方面很容易形成运动式，出现形式化的问题；一方面“被志愿”者在心理上对志愿服务活动会产生抵触情绪。

1.3 试验方法

1.3.1 山西老陈醋醋醅中醋酸菌的分离纯化

采用无菌生理盐水稀释醋醅样品，选取合适稀释度的稀释菌液涂布于醋酸菌固体培养基平板上，30 ℃条件下培养48 h后，挑取单菌落再次划线于醋酸菌固体培养基进行分离纯化，30 ℃条件下培养48 h后，观察菌落形态，挑取具有透明圈的单菌落进行革兰氏染色，镜检，观察细胞形态特征。

1.3.2 山西老陈醋醋醅中醋酸菌的分子生物学鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，利用引物27F（5'-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3'）[19]进行PCR扩增。PCR扩增体系：引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，模板2 μL，2×Mix 20 μL，双蒸水（ddH2O）14 μL；PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min。将测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA5.0生物学软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树，确定菌株种属关系。

1.3.3 醋酸菌菌株的基因分型

以分离的醋酸菌菌株基因组DNA为模板，采用随机引物ERIC1（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'）和ERIC2（5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）进行PCR扩增。PCR扩增体系（30 μL）：引物3 μL，模板3.5 μL，2×Mix 15 μL，双蒸水（ddH2O）8.5 μL；PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后在凝胶成像系统上观察分析，进行ERIC分型。

1.3.4 醋酸菌菌株的发酵特性研究

（1）耐受性能测定

（2）产酸、产乙偶姻性能测定

将分离纯化的醋酸菌分别接种于醋酸菌液体培养基，30 ℃、150 r/min条件下培养24 h，以2%（V/V）接种量接入100 mL醋酸菌液体培养基，30 ℃、150 r/min条件下培养24 h，按照文献[21-22]中的方法对菌株产酸和产乙偶姻的能力进行测定。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌的分离及鉴定

从山西老陈醋醋醅中共分离纯化得到20株醋酸菌，分别编号为菌株SAV-CP-6、SAV-CP-25、SAV-CP-28、SAV-CP-37、SAV-CP-38、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-160、SAV-CP-170、SAV-CP175、SAV-CP-1839、SAV-CP-1842、SAVCP-1843、SAV-CP-1870、SAV-CP-1884。选取典型菌株SAVCP-77，观察其形态，其菌落形态和细胞形态（1 000×）见图1。由图1可知，菌落直径为2 mm，呈规则圆形，乳白色，半透明，光滑，有光泽，细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阴性（G-）。

图1 山西老陈醋醅中典型醋酸菌SAV-CP-77的菌落（A）和细胞（B）形态Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of typical acetic acid bacterium SAV-CP-77 from Shanxi aged vinegar Cupei

2.2 醋酸菌的分子生物学鉴定

20株醋酸菌菌株系统发育树见图2。

图2 基于16S rDNA基因序列20株醋酸菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 20 strains of acetic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由图2可知，菌株SAV-CP-175、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-37、SAV-CP-1870、SAV-CP-170、SAV-CP-25、SAVCP-80、SAV-CP-160、SAV-CP-1839、SAV-CP-1884、SAV-CP-1842、SAV-CP-1843、SAV-CP-77、SAV-CP-6、SAV-CP-74、SAV-CP-73、SAV-CP-156与模式菌株巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）（FJ227313.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KT724709.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KY287771.1）聚于一支，亲缘关系最近，最高可达到96%，因此，将这些菌株鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），菌株SAVCP-28、SAV-CP-38与模式菌株醋化醋杆菌（Acetobacter pomorum）（KF030772.1）、（Acetobacter pomorum）（NR114684.1）聚于一支，亲缘关系最近，最高可达到99%，因此，将这些菌株鉴定为醋化醋杆菌（Acetobacter pomorum）。

苏俊霞[2]采用16S rDNA测序从镇江香醋醋醅中分离鉴定出22株巴氏醋杆菌、5株醋化醋杆菌、5株中间葡萄醋杆菌、3株木醋杆菌（Acetobacter xylinum）；胡会萍等[3]采用传统菌种分离方法从山西老陈醋醋醅中分离出巴氏醋杆菌Ab7、醋化醋杆菌Af10、液化醋杆菌（Acetobacter liquefa-ciens）Af5、汉氏醋杆菌（Acetobacter hansenii）Au13和恶臭醋杆菌（Acetobacter rancens）Af20；郭旭凯等[4]也从山西老陈醋中分离出巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）、醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），液化醋杆菌（Acetobacter liquefaciens）和恶臭醋酸杆菌（Acetobacter rancens）。综上所述，不同地域、不同类型的醋种由于原料、工艺不同，主要的优势醋酸菌菌属也不同，而同一醋种类型，由于不同厂家酿醋工艺及地理环境的差异性，醋酸菌菌群结构也体现出差异性。

2.3 山西老陈醋醋醅中醋酸菌菌株的基因分型

为了解山西老陈醋醋醅中醋酸菌种内菌株的基因多样性，采用ERIC技术对20株醋酸菌菌株进行基因分型，结果见图3。由图3A可知，18株巴氏醋杆菌主要呈现I、II、III、IV、Ⅴ共5个型别。其中菌株SAV-CP-25、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-1842、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAV-CP-1884归为I型，菌株SAV-CP-37、SAVCP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-6、SAV-CP-175归为II型，菌株SAV-CP-1839、SAV-CP-160属于III型，菌株SAV-CP-1870属于IV型，菌株1843属于Ⅴ型。由图3B可知，2株醋化醋杆菌分为两个不同的型别，其中菌株SAV-CP-28归为I型，菌株SAV-CP-38归为II型。HIDALGO C等[23]对传统发酵柿子醋中分离出的糖化葡萄糖酸杆菌（Gluconacetobacter saccharivorans）、巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）、醋酸合胞菌（Acetobacter syzygii）、中间葡萄醋杆菌（Gluconacetobacter intermedius）和欧洲葡萄酸杆菌（Gluconacetobacter europaeus）进行鉴定，并进一步进行ERIC-PCR分型，结果共检测到28种不同的醋酸菌基因型；GONZÁLEZ Á 等[24]采用ERIC-PCR对红酒发酵中醋酸菌进行分型，结果表明，20株醋酸菌具有33种不同的ERIC分型。综上所述，来源于老陈醋醋酸发酵过程中的20株醋酸菌具有菌株基因多样性，可为菌株特性分析提供遗传学基础。

图3 山西老陈醋醋醅中醋酸菌的ERIC基因分型结果Fig.3 Results of ERIC genotyping of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4 山西老陈醋醋醅中醋酸菌的耐受性研究

2.4.1 温度耐受性

山西老陈醋独特的低温酒化和高温醋化酿造工艺，赋予了老陈醋风味醇厚、纯正的特点。其中高温醋化则需要醋酸菌菌种具有优良的高温耐受性。20株醋酸菌的温度耐受性见图4。由图4可知，随着温度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趋势。温度为30～45 ℃时，各醋酸菌生长较好，温度升至50 ℃时，各醋酸菌的生长受到一定抑制。

图4 山西老陈醋醋醅中20株醋酸菌菌株的温度耐受性Fig.4 Temperature tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

整体来讲，巴氏醋杆菌的Ⅱ型菌株的温度耐受性优于Ⅰ型，醋化醋杆菌的Ⅱ型菌株的温度耐受性优于Ⅰ型。其中耐受性能优良的菌株依次为：Ⅲ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1839，Ⅱ型巴氏醋杆菌SAV-CP-41、SAV-CP-170，Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-74，当温度达到50 ℃时，巴氏醋杆菌SAVCP-1839的OD600nm值为0.248。

2.4.2 酒精耐受性

在食醋酿造的酒精发酵末期，其酒精度可以达到9% vol左右，因此筛选高酒精耐受性醋酸菌菌株对于快速启动醋酸发酵具有重要意义。20株醋酸菌的酒精耐受性见图5。由图5可知，随着酒精度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趋势。酒精度为6% vol～8% vol的条件下，各菌株生长较好，酒精度升至10% vol时，各菌株的生长开始受到一定抑制，酒精度升至12% vol，各菌株的生长受到明显抑制。Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋杆菌SAV-CP-175、SAV-CP-41和Ⅰ型醋化醋杆菌SAV-CP-28在各酒精度条件下生长较好，表现出较好的耐受性；其中Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1884在酒精度为10% vol时生长最为旺盛，可耐受10% vol的酒精度。张志燕等[25]从镇江香醋醋醅中得到醋酸菌D-3-4可耐受体积分数为9%的乙醇。

图5 山西老陈醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酒精耐受性Fig.5 Alcohol tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4.3 酸度耐受性

20株醋酸菌菌株的酸耐受性见图6。由图6可知，整体来讲，醋化醋杆菌的耐酸性低于巴氏醋杆菌。在pH为5的条件下，各菌株生长较好，当pH降至3时，各菌株的生长受到一定影响。Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-77、SAV-CP-156、SAV-CP-74、SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋杆菌SAV-CP-37、SAV-CP-40、SAV-CP-175，Ⅲ型巴氏醋杆菌SAV-CP-160在各酸度条件下生长较好，表现出较好的耐受性。Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1884的酸耐受性最强，在pH为3时，OD600nm值为0.223。

图6 山西老陈醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酸度耐受性Fig.6 Acidity tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.5 不同分型醋酸菌产酸、产乙偶姻的特性研究

2.5.1 产乙酸能力

乙酸是山西老陈醋酸味的主要成分，其含量与产生速率对山西老陈醋的品质及发酵工艺都有着深远的影响[26]。因此，筛选高产酸的醋酸菌菌株对于山西老陈醋的提质增效具有重要理论依据。20株醋酸菌菌株的乙酸产量见图7。

图7 山西老陈醋醋醅中20株醋酸菌菌株产乙酸能力的测定结果Fig.7 Determination results of acetic acid production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由图7可知，20株醋酸菌的乙酸产量在0.30～9.87 g/L之间，整体来讲，醋化醋杆菌产乙酸能力要低于巴氏醋杆菌。Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-156、SAV-CP-1884、SAV-CP-73、SAV-CP-74、SAV-CP-80，Ⅱ型巴氏醋杆菌SAV-CP-41、SAVCP-6和Ⅴ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1843的乙酸产量均在6.0 g/L以上，其中Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1884的乙酸产量最高，为9.87 g/L。

2.5.2 产乙偶姻能力

20株醋酸菌菌株的产乙偶姻能力见图8。

图8 山西老陈醋醋醅中20株醋酸菌菌株产乙偶姻能力测定结果Fig.8 Determination results of acetoin production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由图8可知，20株醋酸菌产乙偶姻能力差异较大，醋化醋杆菌产乙偶姻性能弱于巴氏醋杆菌。Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-73、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAVCP-1884，Ⅱ型巴氏醋杆菌SAV-CP-175和Ⅲ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1839菌株产乙偶姻性能较强，达到0.52 mg/mL以上。其中Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-73的乙偶姻产量最多，为0.97 mg/mL，Ⅰ型巴氏醋杆菌SAV-CP-1884的乙偶姻产量次之，为0.86mg/mL。乙偶姻是山西老陈醋重要功能活性物质—川芎嗪的重要前体[27]。刘娜[27]对镇江香醋醋酸发酵过程川芎嗪前体的生物合成途径进行研究，发现乙偶姻、双乙酰及铵根离子是川芎嗪合成的重要前体物质。陈继承等[28]对食醋中乙偶姻和川芎嗪含量进行测定发现食醋中乙偶姻和川芎嗪含量具有显著的相关性。

3 结论

通过传统培养分离方法从山西老陈醋醋醅中共分离出20株醋酸菌，经形态观察及分子生物学鉴定，鉴定18株醋酸菌为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），2株醋酸菌菌为醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）。采用ERIC技术对其基因进行分型，结果表明，醋酸菌种内具有基因多样性，18株巴氏醋杆菌共有5个分型（I～V型），2株醋化醋杆菌共有2个分型（Ⅰ和Ⅱ型）。通过发酵特性研究发现，巴氏醋杆菌及醋化醋杆菌的Ⅱ型菌株的温度耐受性均优于Ⅰ型；巴氏醋杆菌Ⅰ型菌株产酸、产乙偶姻能力优于其他型的菌株。在此基础上，筛选出1株性能良好的菌株为巴氏醋杆菌SAV-CP 1884，其可耐受高温45 ℃、酒精度10% vol以及pH 3的酸性环境，乙酸产量高达9.87 g/L、乙偶姻产量为0.86 mg/mL。