次旦卓玛

(西藏日喀则市农业科学研究所，西藏 日喀则 857000)

马铃薯是很多人喜爱的一种食物，不仅营养价值丰富，而且有抗衰老、减肥、防脱发等诸多功效。越来越多的人都喜欢这一健康食物，因此，马铃薯的市场发展前景巨大，我国也将其列为中国第5大粮食作物。西藏农业产业中马铃薯成为重点发展产业，成为帮助当地民众脱贫致富的主要产业。近年来西藏地区主要将脱毒种薯繁育与质控管理作为工作重点，但在马铃薯脱毒试管苗规模化快繁研究中经常出现脱毒试管苗受污染问题，极大影响到马铃薯原种生产成本与生产品质。为此，如何防范马铃薯脱毒试管苗污染，提高快繁效率，成为当前马铃薯生产亟待解决的一个重要问题。

1 关于脱毒马铃薯的概述

所谓脱毒种薯就是利用一系列技术将马铃薯种薯内的病毒清除掉，得到健康无病毒或极少带病毒的种薯[1]。脱毒种薯不仅品质优良、早熟，而且高产。种薯与马铃薯的产量与品质有着紧密的联系。如果种薯质量差，则马铃薯产量与品质将明显下降，马铃薯植株与块茎遭到病毒侵入，将导致其迅速退化，表现出多种病症，从而造成马铃薯严重减产。为此，要借助相关物理、化学、生物方面的技术尽量清除薯块中所存在的病毒，获得安全、无毒的种薯。目前，研究发现，导致马铃薯退化的病毒有30多种，对马铃薯危害最严重的有6种，包括马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯S病毒(PVS)及马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)。根据马铃薯种植实践经验发现，叶片卷曲皱缩、颜色不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量呈下降趋势，说明马铃薯已出现“退化”。病毒感染是造成种薯“退化”的重要原因，病毒会逐渐在薯块内部积累，造成产量下降，马铃薯品质变差[2]。在病毒的不断侵染与累积影响下，作为下一代“种子”的薯块无法自行清除体内的病毒，从而使病毒侵染逐年加重。这将阻碍马铃薯植株充分发挥自身品种的优势，导致大幅减产。通过借助生物技术清除种薯内部病毒，使其相关生理功能与生产特性得到恢复，才能防范马铃薯发生退化，从而确保马铃薯获得最佳的商品性状与产量。这正是种薯脱毒的原因，也是脱毒马铃薯能够促进增产增收的主要原因。

2 脱毒马铃薯试管苗快繁过程中的污染病变及表现

马铃薯脱毒试管苗快繁研究中主要会采用组织培养技术，而难免会存在试管苗污染问题。其中，污染病原大多数是细菌与真菌2类。细菌污染一般在接种24～48h就会出现，通常可见培养基或材料表面存在黄色或乳白色黏液状物体，菌落有浑浊的水迹状，有时可见菌落呈泡沫发酵状。真菌污染则表现症状出现较为迟缓，通常在接种5～10d才可见症状。当刚发生污染时可见到雾斑，呈针状，之后会形成菌丝，短时间内长出孢子，颜色为黑、白、绿、黄。

3 脱毒马铃薯试管苗污染的常见原因

3.1 苗源与苗源瓶受到污染

苗源瓶内的苗源受到杂菌的侵染，因为是感染初期，菌源过小，一般难以被肉眼发现。将其接种到培养基瓶内将会导致更多苗源瓶感染。苗源瓶常常携带有一些杂菌、细菌、真菌、霉菌，原因在于表面消毒不充分彻底。在接种操作时容易被带入接种瓶，导致感染。

3.2 培养基带菌

培养基需通过湿热灭菌法处理，但偶尔有部分耐高温杂菌不会被杀死，或者在高压灭菌处理培养基时灭菌不彻底导致部分杂菌残留。通过高压消毒的培养基未缓放3～4d，在高压消毒后就开始接种，因此，带菌的培养基直接被用于接种，从而导致人为感染[3]。

3.3 操作传染与气流带菌

工作人员在开展接种工作时自身携带细菌或者使用器械消毒处理不彻底带菌。如，工作人员在对双手消毒时不彻底、不仔细，对剪刀、镊子等器械消毒不到位，容易将细菌带到培养基上。气流传菌主要是接种室与组培室内空气中存在一些杂菌。当工作人员在接种操作的过程中大声讲话，拿放物体不轻缓，从而容易造成脱毒苗与培养基再次受到污染。

4 防范对策

4.1 接种前彻底清除污染菌源

4.1.1 清除容器杂菌

要确保容器清洁，在清洗前需将污染的与未污染的容器分开再进行清洗。清洗后的玻璃容器要发亮，瓶壁没有挂水珠，内外壁水膜均匀。工作人员在拿取容器时注意尽量不要碰到内壁。瓶盖也需仔细刷洗，待晾干后与瓶子存放在一边备用。

4.1.2 清除水质杂菌

选用蒸馏水配制培养基母液，并且将母液放在4℃的冰箱内保存。尽量用蒸馏水或纯净、无色透明、无悬浮物的食用水制作培养基，最大限度避免菌源与杂菌感染。灌装培养基操作要干净利索，确保瓶口与瓶壁未与培养基发生黏结，迅速封口，并及时灭菌。严格执行湿热灭菌操作，等锅内压力增至0.5kg·cm-2时将排气阀打开，待冷空气全部排完后，将排气阀关闭确保压力保持在1.1kg·cm-2左右，温度调节为120～121℃，灭菌时间保持20～25min，最多为30min，从而防止造成培养基成分改变[4]。

4.1.3 选用无污染培养基

培养基经过彻底灭菌处理后需转移至无菌室，在常温条件下放置3～4d，筛选出有杂菌污染的培养基，将其剔除，最后留下干净无菌的培养基用于接种。

4.1.4 接种室要保证干净清洁

在每次开始接种前先用紫外线灯对工作台与接种室内环境进行照射消毒，时间以20～30min为宜，用75%酒精进行喷雾处理。通常隔5～7d对接种室进行彻底消毒1次，按照1∶3的比例配制高锰酸钾与甲醛溶液，在室内熏蒸10～12h，以彻底消灭空气中的各种菌源。要求工作人员的工作服、帽子、口罩都必须保证干净，定期予以消毒。对消毒锅要经常进行检查，评估灭菌效果，一旦发现问题应马上进行检修。

4.2 严格遵循无菌要求开展接种操作

对待转基础苗要反复观察，确认没有污染才可以取用。利用酒精棉充分擦拭待转苗瓶的外侧与瓶盖，以清除附着在上面的杂菌，再将其放置于无菌室。工作人员需洗手更换衣服戴好口罩方可进入无菌室，进入室内后使用75%酒精再次对手进行消毒，才能开展下一步工作[5]。

选用75%酒精作为消毒剂，清洁工作台面与台壁。注意超净工作台上面不可堆放太多的物品，苗源瓶(基础苗)、接种瓶均不宜放置太多，容易引起气流不通畅，从而导致操作区的空气净化不完全，造成不可避免的污染。对接种器械要进行彻底灭菌处理，将镊子、支架、剪刀等工具放在酒精灯外焰上来回消毒，由正到反，从外到内均要消毒，然后放在一旁晾凉。开始接种时工作人员要把瓶口接近酒精灯火焰，完成一瓶接种后，需重新对全部工具进行彻底消毒方可进行下一瓶接种。工作人员在接种操作时要做到动作迅速、规范、熟练，禁止与他人讲话，避免造成污染。接种完毕后必须将培养基瓶口进行严密的封闭处理，从而尽量阻止瓶内与室内空气间形成对流，从而防范气流传菌。

4.3 严密防范内生细菌

Wilson对内生菌的定义为：在整个或部分生活周期中侵染活的植物体，但不会导致植物组织出现明显症状的微生物，主要包括细菌与真菌。材料内部所带细菌大多潜伏较深，常规的表面消毒防范难以将其彻底清除，伴随材料一同参与到培养过程中，进而导致组培污染[6]。

有的时候在外植体的初级培养过程中难以察觉内生细菌，通过逐步繁殖，菌量会逐渐增多，最终在培养基上显现出来。就污染状态分析可知，内生菌污染多见于植物材料的四周，通常从培养基内往外部伸展，其发生时间一般在4d以上，菌的种类也比较单一，而接触性细菌通常在2～4d就会有所症状。

对此，可将相关抑菌剂或抗生素加入到培养基中，低温预处理、减小pH值等措施，用于防范细菌等内生菌的污染。在运用抗生素抑菌时应注意以下几点：对症下药，不可随意使用抑菌剂；选择最合适的抑制浓度；了解抗生素在培养基上面能否起效，稳定性是否良好；确保抗生素对植物不会产生不良影响。此外，应按合理的流程开展扩大繁殖工作。获得脱毒试管苗后需要选取一部分留作“原种”进行储存，通过分批繁殖与复检确定无问题后才能扩大栽植规模。

4.4 加强接种后的管理

4.4.1 人员管理

杜绝非工作人员进入，工作人员在进入前需做好清洁措施，穿戴专门的工作服，套上鞋套，避免将外部杂菌带入。

4.4.2 定期消毒

2～3d对地面消毒1次，消毒剂选用百菌清或甲醛溶液，每周用甲醛熏蒸1次，操作流程为：取50mL甲醛溶液与15g高锰酸钾，将二者混合，并将接种室门窗密闭24h，散发出来的甲醛蒸汽可以清除空气中的相关细菌与真菌。同时，用75%酒精进行喷雾处理。

4.4.3 剔除受污染的瓶苗

要及时将培养室内发生污染的瓶苗剔除，通过高压锅对污染苗进行灭菌处理再进行远距离统一销毁，彻底清除病毒源。对于非常珍贵、稀少的瓶苗发生污染时，若污染程度轻微应采取相应的挽救措施。先把瓶苗从培养室中移出，并用酒精棉遮挡污染部位，剪掉植株顶部，然后将75%酒精作为冲洗剂，冲洗30s左右，并用无菌水冲洗2遍。对容器表面彻底消毒后转移至超净工作台，并用0.1%的Hg2CL2溶液浸泡约5～10min，用无菌水冲洗5遍，转移至新培养基上。经净化处理的材料需要单独保存，与其它脱毒苗分开，观察数日判断没有污染方可转移到原处保存。为强化灭菌效果，一般可选择混合消毒液进行消毒，或多次消毒的办法。若消毒效果不好，可加入适量的抗生素在培养基中。

综上所述，要根据试管苗被污染的常见原因采取有效的应对措施，尽快构建起一套完善的预防马铃薯脱毒试管苗工厂化生产污染问题的相关机制，为实现马铃薯的丰产丰收打好基础。