董雪，姚兆群，曹小蕾，田芳，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

分枝列当(PhelipancheaegyptiacaPers) 属列当科的全寄生性杂草，可寄生葫芦科、茄科、豆科、菊科、伞形科、土字花科等多种植物，可对甜瓜、籽瓜、番茄、马铃薯、烟草、扁豆和胡萝卜等重要经济作物产量造成严重损失[1-3]。分枝列当缺少叶绿素只能通过吸器与寄主维管束连接获得营养，使得难以筛选出有效杀灭分枝列当而对寄主安全的除草剂，同时分枝列当寄生过程主要发生在寄主根部，待其从地下长出后再进行化学防治或者人工拔除，已对寄主造成严重损失。分枝列当的这些生物学特性使其防治极其困难，导致发生严重地区的农民不得不改种经济效益低的作物，甚至弃耕土地[4-6]。了解分枝列当的寄生过程对制定合理的防控策略具有重要意义，已有转录组、基因组数据分析揭示了一些基因与分枝列当种子萌发、吸器形成及与寄主建立寄生关系相关[7-9]，但由于分枝列当是全寄生性杂草，缺乏成熟的转化与再生体系，导致相关基因的功能验证存在困难[10]。

对全寄生种子植物的组织培养研究主要集中于列当科的肉苁蓉上，已从荒漠肉苁蓉的茎、幼芽、鳞片、花瓣、子房、雄蕊和种子等多种组织和器官中诱导得到了愈伤组织，但没有培养出组培苗[11-13]。目前已有采用B5培养基诱导出Phelipancheramosa和用MS培养基诱导出分枝列当愈伤组织的报道，但缺乏进一步的研究[14-15]。本研究的目的是优化一种能够产生大量高效再生的分枝列当愈伤组织的方法，通过优化培养基和不同激素的组合去诱导愈伤组织的产生，并进一步通过激素调节诱导愈伤组织使其分化，最终为采用遗传转化研究分枝列当侵入寄主以及寄主植物抗性之间的相互作用机制提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2018年7月从新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州军户农场加工番茄上采集成熟的分枝列当植株和种子，经形态学和分子生物学鉴定将其鉴定为分枝列当，去除杂质并在常温黑暗条件下保存于实验室备用。

1.2 种子消毒

称取分枝列当种子0.4 g于10 mL离心管中，并在超净工作台上用75%的酒精消毒处理5 min，然后再用含有0.02%(V/V)Tween-20的2%(V/V)次氯酸钠溶液中处理20 min，最后用灭菌的去离子水冲洗5至8次直至上清液变为清澈无色，对种子进行消毒杀菌。

1.3 种子预培养

将1 mL吸头剪去0.5 cm，用洗头吸取消毒处理后的分枝列当种子，均匀点放在铺有2层玻璃纤维滤纸的9 cm培养皿中，并加入2 mL无菌水润湿。所使用的玻璃纤维滤纸、培养皿及吸头均需提前在高温高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，并用锡箔纸包裹培养皿保持黑暗条件。

再将处理好的种子置于24 ℃恒温培养箱中进行种子预培养。预培养4 d后，加入10-7mol/L GR24(人工合成的独脚金内酯类似物)溶液以刺激分枝列当种子萌发，其中所使用的GR24需过滤除菌(在没有种子萌发刺激物的作用下，列当种子不萌发)。

1.4 诱导愈伤组织外植体的筛选

分枝列当种子在预培养4天后，分别选择用GR24处理1、2、3、4、5、6、7 d的种子转入固体培养基中，每个处理设3个重复，4周后统计愈伤组织的诱导率。

1.5 愈伤组织诱导

以MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+600 mg/L水解酪蛋白和B5+3%蔗糖+0.7%琼脂+600 mg/mL水解酪蛋白(pH5.8)为基本培养基，分别添加1 mg/L 2，4-D、1 mg/L IAA、8 mg/L GA3三种激素的相互组合作为愈伤组织的诱导培养基，所用的激素和培养基见表1。

将萌发的分枝列当种子接种于上述培养基上进行黑暗培养，每个培养皿放入约0.03 g分枝列当萌发的种子，每个处理设10个重复，24 ℃暗培养4周后观察并统计所形成愈伤组织颜色，平均直径大小及质地情况，筛选出最适分枝列当愈伤组织生长的条件。

1.6 蔗糖含量对列当组织培样的影响

以B5+0.7%琼脂+600 mg/L酸水解酪蛋白(pH5.8)和B5+0.7%琼脂+600 mg/L水解酪蛋白+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3(pH5.8)为基本培养基，分别添加1%、2%、3%的蔗糖，24 ℃暗培养，第4周观察愈伤组织并统计所形成愈伤组织颜色，平均直径大小及质地情况。

2 结果与分析

2.1 种子处理时间对愈伤组织诱导的影响

以不同GR24处理天数的萌发的列当种子作为外植体对列当愈伤组织的形成具有一定的影响。在GR24处理4～5 d时为诱导愈伤组织最佳处理时间，更长或更短时间的GR24处理天数都不利于分枝列当愈伤组组织的形成，在GR24处理1～2 d时，种子萌发率较低，导致愈伤组织产生率较低，尽管在GR24处理5天以上有种子萌发率较高，但形成芽管较长，且外植体与空气接触面积变大，容易污染，因此，也不利于愈伤组织的形成。

图1 GR24不同处理天数对分枝列当愈伤组织诱导的影响

2.2 培养基及激素对分枝列当愈伤组织诱导的影响

将GR24处理过的萌发的分枝列当种子接种于愈伤组织诱导培养基上，1周左右可在培养基中观察到白色的列当愈伤组织，4周后可观察到愈伤组织形成，直径约1.8 cm 左右，且呈现丝状突起的白色团状物(图2)。在MS培养基上，形成的团状愈伤组织较B5培养基所诱导的愈伤组织小(直径为0.3～0.6 cm)，几乎无丝状突起。说明MS中的营养物质不适合分枝列当的生长发育。

添加生长素与细胞分裂素对植物的愈伤组织诱导有很重要的作用。从表1可知：当培养基中加入2，4-D时，形成的愈伤组织较小，含水量较高，极软易碎，不易成形。GA3的加入有打破种子休眠作用，增加了种子的萌发率，有利于分枝列当愈伤组织的形成。因此，处理5所形成的愈伤组织平均直径最大，且无褐化现象。所以筛选出诱导分枝列当愈伤组织的最佳培养基为B5培养基，所添加激素为IAA为1 mg/L，GA3为8 mg/L。

表1 培养基及生长调节剂对分枝列当愈伤组织形成的影响

图2 分枝列当四周龄愈伤组织

2.3 蔗糖含量对分枝列当分化的影响

蔗糖含量对分枝列当花芽的发育有着非常显著的影响。从表2可知：在无激素添加条件下，随着蔗糖浓度的增加，其质地由疏松逐渐发育为致密。在1%蔗糖处理中，几乎看不到花芽的形成；2%蔗糖含量处理中，分枝列当由愈伤组织继续分化出花芽的数量极少。含量在3%的蔗糖浓度中，1周后已长出较长的芽管(图3A)，2至3周时，出现质地较为致密的愈伤组织图(图3B、C)，4至5周后可以观察到分枝列当的愈伤组织质地较为坚硬，随后分化出淡黄色的花芽(图3D、E)。但是在无寄主的情况下，可以明显观察到分化出花芽的单个个体至少由2个列当种子萌发后形成的，它们可能会通过相互寄生来继续生长(图3F)。

从表2可以看出：处理4和处理5所形成愈伤组织平均直径相同，均为1.8 cm，但在处理5中分枝列当的花芽形成率最高，且无褐化现象。因此，分枝列当愈伤组织分化出花芽的最佳培养基为B5培养基，其蔗糖含量为3%，并且无任何激素的添加。

表2 蔗糖含量对分枝列当愈伤组织花芽分化形成的影响

3 讨论

对寄生性种子植物组织培养和分枝列当同科的全寄生植物肉苁蓉的研究较多，已从荒漠肉苁蓉的茎、幼芽、鳞片、花瓣、子房、雄蕊和种子等多种组织和器官中诱导得到愈伤组织，同时温度、培养基、激素配比、pH值、光照和诱导子等对愈伤组织的培养和PhGs的合成都有影响[11]。朱永华等[12]以肉苁蓉花器、肉质茎、幼芽、鳞片、子房等作为外植体的研究发现，以子房、茎块作为外植体的愈伤组织的诱导率高、时间短，且愈伤组织的质地较好，最适培养条件为B5+1 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA。吴新等[13]用添加BA、IBA和GA3的B5培养基，用肉苁蓉肉质茎诱导出了愈伤组织。然而，所有的组织培养仅仅停留在诱导出愈伤组织，未有进一步的研究文献，这可能与肉苁蓉寄生生长的遗传特性有关。

由于全寄生种子植物分枝列当的生长发育相比其他植物较为特殊，其组织培养得到的分化的花芽寄生能力较弱，因此，后续还需要对诱导出的列当如何与甜瓜根部进一步共培养进行深入研究。

4 结论

以萌发的分枝列当种子为外植体，诱导分枝列当愈伤组织的最佳培养基为B5+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3+600 mg/L水解络蛋白+2%蔗糖+0.7%琼脂；在无寄主的条件下，通过添加适量的蔗糖，可以由愈伤组织分化出淡黄色的花芽，这对于寄生植物组织培养的研究来说是一个大的进步。