潘晓芳 黄燕虹 黄浩然 李海明 陈建起 吴静标★

作者单位：1.广东省医疗器械质量监督检验所综合检验四室，广东，广州510663

2.广州市丰华生物工程有限公司，广东，广州510730

维生素D（vita min D，VD）是人体必需的一类脂溶性类固醇衍生物。体内VD 经两次羟基化，形成具有生物活性的维生素代谢物（1，25⁃二羟基维生素D2，1，25⁃二羟基维生素D3等），其家族中最重要的成员就是25⁃羟基维生素D2（25⁃hydroxyvita min D2，25⁃OH VD2）和25⁃羟基维生素D3（25⁃hy⁃droxyvita min D3，25⁃OH VD3）［1］。《维生素D 及其类似物临床应用共识》指出：血清25⁃OH VD 水平检测已被公认为反映维生素D 状态的最合理指标［2］。LC⁃MS/MS 法能够有效区分25⁃OH VD2 和25⁃OH VD3，比免疫法灵敏度更高，是临床检测维生素D 的金标准［2⁃3］。因此，本研究建立了同时准确快捷测定血清中25⁃羟基维生素D2及25⁃羟基维生素D3的LC⁃MS/MS 法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

采用三重四极杆质谱分析系统（FH⁃6000MD，广州市丰华生物工程有限公司）；色谱柱（Accu⁃core aQ 2.1×50 mm，2.6 μm，Thermo Fisher Scientif⁃ic 公司）；多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；氮气发生器（Peak Scientific 公司）。

1.1.2 主要试剂

25⁃羟基维生素D 测定试剂盒（液相色谱⁃串联质谱法）（广州市丰华生物工程有限公司，批号：20190408）；甲醇：色谱纯，含量≥99.9%（Thermo Fisher 公司）；实验用水为Synergy 超纯水，电阻率不低于18 MΩ·cm⁃1。

1.2 实验参数

1.2.1 质谱参数

色谱柱为Accucore aQ C18 色谱柱（2.1×50 mm，2.6 μm）；柱温为40℃；流速为0.5 mL/min；进样量为10 μL；流动相A 为超纯水（含0.1%甲酸），流动相B 为甲醇（含0.1%甲酸）。采用梯度洗脱：0.0～1.0 min 70%B，1.0～2.0 min 75%B，2.0～2.1 min 98%B，2.1～2.6 min 100%B，2.6～3.5 min 100%B，3.5～3.6 min 70%B，3.6～5.0 min 70%B。质谱参数：离子源为电喷雾离子源（ESI）；离子模式为正极；喷雾电压为3 500 V；离子传输管温度为300℃；喷雾温度为400℃；鞘气流速为50；辅助气流速为12；……