王静杰，杜 鑫，钟 强，董和亮，王 浩,*，夏秀芳,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150030）

海参性腺是海参精深加工的副产物，含有多种生物活性物质，如多糖[1]、多肽[2]、脂肪酸[3]和凝集素[4]。这些物质具有抗肿瘤[1]、抗糖尿病[5]、抗炎[6]、生殖系统保护和降脂[7]的生物活性。然而，在海参的实际加工过程中，其性腺往往被丢弃，从而造成大量的资源浪费和环境污染。为了深入开发利用海参性腺，需要对其活性物质进行研究。多糖作为海参性腺中重要的生物活性成分之一，因其丰富的生物活性而备受关注。目前，国内外专家主要对来源于海参体壁的海参多糖进行抗肿瘤[1]、抗炎[6]等生物活性研究。迄今为止，对海参性腺多糖（sea cucumber gonadal polysaccharide，SCGP）的有效制备方法和生物活性研究鲜有报道。

在海参性腺中，SCGP主要以糖蛋白形式存在[8]，由于蛋白酶可以有效破坏连接糖蛋白的糖肽键，因此可以采用酶法进行制备。而超声辅助酶（ultrasound-assisted enzymatic，UAE）法不仅具有酶法制备的优点，同时可以利用超声空化效应产生的较高能量，大大提高多糖的提取率[9]。目前，UAE法主要应用于植物多糖的制备[10]。

本实验通过UAE法制备海参性腺粗多糖（sea cucumber gonadal crude polysaccharide，SCGCP），分离纯化后得到SCGP-UAE，研究SCGP-UAE的物质组成、结构特性（特征官能团、表观结构和空间构象）、热稳定性和抗氧化活性，同时与酶法、超声法制备的多糖进行比较，分析SCGP-UAE的结构特性及生物活性，旨在为其深入开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海参（海刺参）性腺购自大连水产集团有限公司。

中性蛋白酶 北京旭日生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB）、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、葡萄糖，VC、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 上海远业生物技术有限公司；10 kDa透析袋 北京雅米生物科技有限公司；岩藻糖（fucose，Fuc）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannose，Man）、核糖（ribose，Rib）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal-UA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc-UA）、甘露糖醛酸（mannuronic acid，Man-UA）标准品 北京索莱宝科技有限公司。所有其他化学品和试剂均为分析纯或更高纯度。

1.2 仪器与设备

AL-104型精密电子天平、FE20K型pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器设备有限公司；Scientz-II D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-1型冻干机 上海分析仪器公司；UT-1800紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪美国珀金埃尔默公司；S-3400N扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；SDT650同步热分析仪 美国TA仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海参性腺冻干粉预处理

海参性腺经真空冷冻干燥机冻干，粉碎后过50 目筛备用。将30 mL氯仿-甲醇溶液（体积比为2∶1）混匀，加入1.00 g海参性腺冻干粉，500 r/min磁力搅拌反应2 h后，6 000 r/min离心10 min。弃去上清液，向沉淀中加入30 mL丙酮，500 r/min磁力搅拌反应12h，离心（6 000 r/min、10 min），去除上清液，将沉淀氮气吹干得到脱脂、脱色海参性腺粉。

1.3.2 海参性腺多糖的制备

1.3.2.1 酶法制备

SCGCP的酶法制备参考Vieira等[11]的方法：将40 mL蒸馏水加入至1.00 g脱脂脱色海参性腺粉中，漩涡混匀后调节溶液pH值为7.5。加入1.2×104U/g中性蛋白酶，混匀，50 ℃水浴反应6 h后于95 ℃灭活10 min，以终止反应。将反应后的溶液5 000 r/min离心10 min，取上清液，加入4 mL 100 g/L CTAB溶液，静置反应12 h后离心（6 000 r/min、10 min）。弃去上清液，将沉淀溶解于15 mL 3 mol/L NaCl-乙醇溶液（体积比100∶15）中，随后加入80 mL 95%乙醇溶液，于4 ℃静置12 h以沉淀多糖。6 000 r/min离心10 min后去除上清液，加入蒸馏水将沉淀溶解，用10 kDa透析袋将溶液透析24 h后冷冻干燥得到酶法制备的粗多糖冻干粉末。

1.3.2.2 超声法制备

SCGCP的超声法制备按照Duan Mengying等[10]的方法进行：向1.00 g脱脂脱色海参性腺粉中加入40 mL蒸馏水，涡旋混匀后在400 W超声50 min，将反应后的溶液于6 000 r/min离心10 min，收集上清液。再按1.3.2.1节中的方法加入CTAB溶液反应12 h后进行离心、复溶、醇沉、离心、复溶及透析冻干，得到超声法制备的粗多糖冻干粉末。

1.3.2.3 超声辅助酶法制备

SCGCP的UAE法制备：首先采用1.3.2.2节中的方法超声处理1.00 g脱脂脱色海参性腺粉，然后采用1.3.2.1节酶法制备条件稍加修改。其中，将酶添加量改为0.8×104U/g，酶解时间缩短为4 h，最终得到UAE法制备的粗多糖冻干粉末。

1.3.2.4 分离纯化

使用DEAE-Sepharose凝胶快速流动阴离子交换柱（2.6 cm×40 cm）对3 种SCGCP进行初步的分离纯化，用0～1 mol/L NaCl溶液以4 mL/min的流速梯度洗脱，收集馏分。通过苯酚-硫酸法[12]测定各管溶液的总糖含量，并以管数为横坐标，以490 nm波长处测定的吸光度为纵坐标制作洗脱曲线。

收集3 个样品洗脱曲线的最高峰，用0.5 mol/L NaCl以0.5 mL/min的流速在Sephadex G-200柱（1.5 cm×100 cm）上进一步纯化。3 种多糖纯化产物的洗脱峰对称，表明纯化结果良好。收集洗脱峰对应管中的溶液，透析后冷冻干燥得到3 种SCGP，分别记为SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE。

1.3.3 海参性腺多糖的化学成分测定

SCGP的总糖质量分数采用苯酚-硫酸法[12]测定：以葡萄糖作为标准品，在490 nm波长处测定吸光度，标准曲线方程为y＝0.009 4x+0.011 9（R2＝0.999 3）。

SCGP的蛋白质量分数采用福林-酚法[13]测定：以牛血清白蛋白作为标准品，在500 nm波长处测定吸光度，标准曲线方程为y＝0.002 7x+0.037 8（R2＝0.999 3）。

SCGP的硫酸基质量分数采用BaCl2-明胶法[14]测定：以硫酸钾作为标准品，在360 nm波长处测定吸光度，标准曲线方程为y＝0.063 1x+0.024 5（R2＝0.998 4）。

SCGP的分子质量采用高效凝胶排阻色谱-示差-多角度激光光散射法[15]测定：取10 mg样品溶解于1 mL 0.1 mol/L硝酸钠溶液中，14 000 r/min离心10 min后取上清液，将上清液经0.22 μm滤膜过滤后备用；柱温为45 ℃，加样量为100 μL，流动相为0.1 mol/L的NaNO3。

SCGP的单糖组成采用Zhu Minqian等[16]的方法通过Thermo ICS 5000+离子色谱联合电化学检测器进行分析检测：色谱柱为DionexTMCarboPacTMPA10（250 mm×4.0 mm，10 μm）；柱温为45 ℃；进样体积为20 μL；流动相A为超纯水；流动相B为100 mmol/L NaOH；流动相梯度洗脱程序：时间梯度为0→30→45→60 min，洗脱梯度为流动相B 2.5%→20%→40%→2.5%。

1.3.4 海参性腺多糖的紫外光谱分析

SCGP的紫外光谱扫描：将SCGP用蒸馏水配制成0.5 g/L的多糖溶液，使用UT-1800紫外-可见分光光度计在190～400 nm范围内对其进行光谱扫描。

1.3.5 海参性腺多糖的FTIR分析

SCGP的FTIR参数[1]：扫描范围为4 000～400 cm-1，波数分辨率为4 cm-1。

1.3.6 海参性腺多糖的表观形态分析

SCGP的表观形态使用SEM进行观察[1]：电子加速电压为5.00 kV，放大倍数为1 500 倍。

1.3.7 海参性腺多糖的空间构象分析

SCGP的空间构象采用刚果红法[9]进行分析：将2 mL 2.5 mg/mL的SCGP溶液与2 mL 80 mmol/L的刚果红剧烈搅拌混合，依次加入不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L及0.5 mol/L）的NaOH溶液，使用UT-1800紫外-可见分光光度计对其进行扫描，得到其最大吸收波长。

1.3.8 海参性腺多糖的热稳定性分析

通过差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）法和热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）来表征SCGP结构的热稳定性，采用同步热分析仪进行测定[15]：温度范围为30～800 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.3.9 海参性腺多糖的抗氧化活性分析

1.3.9.1 海参性腺多糖ABTS阳离子自由基清除率的测定

SCGP的ABTS阳离子自由基清除率采用Yang Tao等[17]的方法进行测定：将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾等体积混合后避光反应12 h，制备ABTS阳离子溶液。用甲醇稀释至734 nm波长处吸光度为0.700±0.020。将1.0 mL不同质量浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL）的SCGP溶液添加到4.0 mL ABTS溶液中，室温反应6 min后，测定其在734 nm波长处的吸光度。以VC作为阳性对照，根据式（1）计算SCGP的ABTS阳离子自由基清除率。

式中：A0为不加样品的吸光度；A1为加入样品后的吸光度。

1.3.9.2 海参性腺多糖O2-·清除率的测定

SCGP的O2-·清除率采用Li Yun等[18]的方法进行测定：取5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）于试管中，25 ℃水浴保温10 min。将1.0 mL不同质量浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL）的SCGP溶液分别与1.0 mL 6 mmol/L的邻苯三酚混合，随后加入1.0 mL 8 mol/L的HCl溶液以终止反应，测定溶液在320 nm波长处的吸光度。以VC作为阳性对照，根据式（2）计算SCGP的O2-·清除率。

式中：A0为等体积去离子水代替样品的吸光度；A1为加入样品后的吸光度；A2为等体积去离子水代替邻苯三酚和盐酸溶液的吸光度。

1.3.9.3 海参性腺多糖亚铁离子螯合能力的测定

SCGP的亚铁离子螯合能力采用Medlej等[19]的方法进行测定：将100 μL不同质量浓度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL）的多糖样品分别与50 μL 2 mmol/L FeCl2混合，并剧烈搅拌5 min。然后同时添加100 μL 5 mmol/L的菲洛嗪与2.75 mL的超纯水。在室温下反应10 min后，测定在562 nm波长处的吸光度。以EDTA作为阳性对照，根据式（3）计算SCGP的亚铁离子螯合能力。

式中：A0为不加样品的吸光度；A1为加入样品后的吸光度。

1.4 数据处理与分析

所有实验重复3 次，结果表示为平均值±标准差。数据使用Statistix 8.1软件进行分析，通过Duncan检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用Sigmaplot 12.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 海参性腺多糖的化学组成

SCGP的化学组成如表1所示。经分离纯化后，SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE中蛋白几乎被完全去除，蛋白质量分数分别为0.54%、0.76%和0.55%。SCGP-UAE的总糖质量分数（69.13%）和硫酸基质量分数（14.73%）显著高于SCGP-E（58.76%、10.58%）和SCGP-U（62.93%、13.27%）（P＜0.05）。多糖中硫酸基含量越高，其生物活性越高[20]。SCGP-UAE的分子质量（30.70 kDa）显著小于SCGP-E（102.33 kDa）和SCGP-U（63.70 kDa）（P＜0.05）。

表1 不同方法制备SCGP的化学组成Table 1 Chemical composition of polysaccharides from sea cucumber gonad prepared by different methods

SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的单糖组成见表1。3 种多糖均含有Fuc、Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man、Gal-UA和Glc-UA，但物质的量分数不同。此外，在SCGP-E和SCGP-U中存在Rib，在SCGP-U和SCGP-UAE中存在Man-UA。SCGP-E单糖组成的物质的量之比为Fuc∶Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Xyl∶Man∶Rib∶Gal-UA∶Glc-UA＝17.58∶0.61∶1.22∶14.22∶15.29∶4.59∶6.42∶19.88∶1.07∶19.11，SCGP-U的单糖组成的物质的量之比为Fuc∶Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Xyl∶Man∶Rib∶Gal-UA∶Glc-UA∶Man-UA＝29.67∶6.48∶2.36∶9.04∶19.65∶0.59∶5.30∶17.49∶0.20∶9.04∶0.20，SCGP-UAE的单糖组成的物质的量之比为Fuc∶Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Xyl∶Man∶Gal-UA∶Glc-UA∶Man-UA＝51.21∶4.98∶0.73∶25.05∶7.33∶6.81∶3.08∶0.51∶0.07∶0.22。3 种SCGP的单糖组成出现差异的可能原因为：1）酶法与UAE提取可能会导致多糖链的水解以及分子之间氢键的断裂[21]，从而影响SCGP的单糖组成；2）酶和超声波可以将细胞中的不溶物降解为可溶性碳水化合物，从而导致多糖单糖组成的改变[22]。

2.2 海参性腺多糖的纯度鉴定

SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的紫外吸收光谱如图1所示。3 种多糖在190～200 nm处都有较强的吸收峰，为多糖的特征吸收峰[23]。此外，在260 nm和280 nm波长处，SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE均没有吸收信号，说明3 种多糖中均不存在核酸和蛋白质[24]，分离纯化后SCGP的纯度较高，与表1中蛋白质量分数分析结果一致。

图1 SCGP的紫外光谱Fig. 1 Ultraviolet absorption spectra of SCGP

2.3 海参性腺多糖的FTIR特征基团分析结果

3 种方法制备SCGP的FTIR如图2所示，它们具有与典型多糖吸收峰相似的光谱。在3 346 cm-1附近有光滑而宽阔的强吸收峰，为O-H拉伸吸收峰，该吸收峰受到分子间或分子内氢键的影响[25]。1 701 cm-1处的吸收峰表明SCGP内含有游离羧基[26]。同时，1 253 cm-1处的特征吸收峰为羧基内C＝O键的对称或不对称伸缩振动，这表明SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE为酸性多糖[27]。在1 097 cm-1附近处的吸收峰为C—O—H侧基的弹性振动和C-O-C糖苷键振动所引起[28]。在960 cm-1处的吸收峰为糖类分子振动产生的吸收峰[29]。820 cm-1处的吸收峰为C—O—S的对称伸缩振动所引起，表明SCGP中存在硫酸盐基团[30]。

图2 SCGP的FTIR图Fig. 2 FITR spectra of SCGP

2.4 海参性腺多糖的表观形态

SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的表观形态如图3所示。在1 500 倍电子显微镜下，3 种多糖均为薄片状，表面光滑。与SCGP-E相比，SCGP-U和SCGP-UAE的表面增加许多碎片结构。其中，SCGP-E具有较高的聚集度，这可能与其分子质量较高有关[31]，而SCGP-U和SCGP-UAE由于分子质量较小，相对松散，使其具有较大的表面积[32]。

图3 SCGP-E（A）、SCGP-U（B）和SCGP-UAE（C）的SEM图Fig. 3 SEM images of SCGP-E (A), SCGP-U (B) and SCGP-UAE (C)

2.5 海参性腺多糖的空间构象

在碱性溶液中，具有三股螺旋结构的多糖与刚果红发生络合反应，使溶液的最大吸收波长与刚果红溶液相比发生红移现象，由此能够判断多糖是否具有三股螺旋结构[33]。由图4可知，3 种方法制备的SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE与刚果红进行反应，其最大吸收波长均随着NaOH溶液浓度的增加呈现下降趋势，说明SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE中均不存在三股螺旋结构。这是由于这3 种多糖均含有多种单糖，而杂多糖不宜形成三股螺旋结构[34]。

图4 刚果红-SCGP络合物的最大吸收波长Fig. 4 Maximum absorption wavelengths of Congo red complexes of polysaccharides from sea cucumber gonad

2.6 海参性腺多糖的热稳定性结果

SCGP-E、SCGP-U、SCGP-UAE的DSC结果如图5A所示。SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE分别在64.27、80.59、87.25 ℃时出现多糖自由水的损失；多糖的放热峰峰值分别出现在429.21、432.09、485.74 ℃处，此时样品发生分解或氧化降解反应，放热峰值温度越高，表明样品的热性能越稳定[35]。从放热峰值温度来看，SCGPUAE的热稳定性优于SCGP-E和SCGP-U。

图5 SCGP的DSC（A）和TGA（B）图谱Fig. 5 DSC (A) and TGA (B) profiles of polysaccharides from SCGP

SCGP-E、SCGP-U、SCGP-UAE的TGA结果如图5B所示。当加热到100 ℃时，SCGP-E、SCGP-U和SCGPUAE的质量损失分别为16.70%、16.45%和8.39%，这主要是自由水蒸发造成的。将SCGP-E、SCGP-U和SCGPUAE样品进一步分别加热到212.31、208.45、185.24 ℃时，多糖内部含有的束缚水被释放并蒸发为水蒸气。随着温度加热到500 ℃左右，可以观察到3 种多糖均损失了大部分质量，此时发生的热降解是由于糖苷键随机断裂和样品的转移而产生[36]。当加热到790 ℃时，SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的样品残留质量分数分别为23.80%、33.77%和36.22%。

DSC和TGA结果表明，SCGP-E、SCGP-U、SCGP-UAE拥有良好的热稳定性，有研究指出良好的热稳定性有利于多糖在食品和制药生产中的应用[37]。

2.7 海参性腺多糖的抗氧化活性分析结果

2.7.1 海参性腺多糖的ABTS阳离子自由基清除率

SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的ABTS阳离子自由基清除率如图6A所示，3 种多糖对ABTS阳离子自由基的率效果与其质量浓度均呈剂量-效应关系，其中，SCGP-UAE的ABTS阳离子自由基清除率显著高于SCGP-E和SCGP-U（P＜0.05）。当多糖质量浓度为4.0 mg/mL时，SCGP-UAE的ABTS阳离子自由基清除率较SCGP-U和SCGP-E分别提高5.59%和2.16%。相关研究表明，多糖清除ABTS阳离子自由基的过程涉及电子转移，多糖可提供的电子越多，其ABTS阳离子自由基清除能力越强[38]，因此可以推测SCGP-UAE较SCGP-E和SCGP-U能提供更多的电子，这与SCGP-UAE具有更高的硫酸盐含量有关[20]。当多糖质量浓度为4.0 mg/mL时，SCGP-UAE与传统抗氧化剂VC的ABTS阳离子自由基清除率无显著差异（P＞0.05）。结果表明，超声辅助酶解法可作为高抗氧化性SCGP的有效制备技术。

图6 SCGP的体外抗氧化活性Fig. 6 Antioxidant activity in vitro of polysaccharides from sea cucumber gonad

2.7.2 海参性腺多糖的O2-·自由基清除率

SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE对O2-·的清除能力如图6B所示。3 种方法制备的SCGP对O2-·的清除活性均具有剂量-效应关系，清除能力依次为SCGP-UAE＞SCGP-U＞SCGP-E。通常天然多糖的抗氧化活性与其高硫酸盐含量[39]和低分子质量[40]有关。硫酸盐含量高、分子质量低是SCGP-UAE抗氧化活性较强的原因。当多糖质量浓度为4.0 mg/mL时，SCGP-UAE的O2-·清除率为56.44%，分别较SCGP-U和SCGP-E提高14.05%和33.59%；此时，VC的清除率为91.86%。结果表明，SCGP糖具有一定的O2-·清除能力，但显著低于VC（P＜0.05）。

2.7.3 海参性腺多糖的亚铁离子螯合能力

一些过渡金属离子如Fe2+、Cu+、Pb2+、Co2+等能促使活性氧的产生，其中Fe2+的促氧化能力最强[41]，因此研究SCGP对Fe2+的螯合作用具有重要意义。如图6C所示，SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE的亚铁离子螯合能力均随着多糖质量浓度升高而增强。在0.25～4.0 mg/mL的质量浓度范围内，SCGP-UAE的亚铁离子螯合能力显著高于SCGP-E和SCGP-U（P＜0.05）。在4.0 mg/mL时，SCGP-UAE的亚铁离子螯合能力为95.93%，较SCGP-U和SCGP-E分别提高26.63%和47.10%，与VC（99.27%）无显著差异（P＞0.05）。Wang Jing等[42]研究发现，多糖的生物活性（如抗氧化活性）是由于多糖中存在硫酸基团，此外，Li Siqian等[43]发现硫酸基团具有Fe2+螯合能力。

3 结 论

研究结果表明，制备方法对SCGP的结构特征及抗氧化活性具有较大影响。3 种海参性腺多糖SCGP-E、SCGP-U和SCGP-UAE均不含三股螺旋结构，它们的紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和单糖种类相似，但总糖质量分数、硫酸基质量分数、分子质量、单糖组成比例及热稳定性间存在显著差异。其中，SCGP-UAE的总糖质量分数、硫酸基质量分数及热稳定最高，分子质量最低，抗氧化活性最佳，表明其结构特性与抗氧化活性间存在相关性。因此，结合多糖结构及生物活性等因素可知，超声波辅助酶法是一种很有潜力的海参性腺多糖工业制备技术。本研究结果可为SCGP-UAE在功能性保健品中的开发和应用提供一定的依据，但SCGP-UAE的体内抗氧化活性有待进一步研究。