罗友梅 陈瑞雅 李小勇 张锐杰 李思思 李锐新 贺新生

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

食用菌生产者、研究者普遍使用各种生物显微镜对食用菌菌丝体、霉菌、细菌等培养物进行观察，传统的方法都需要用载玻片制片观察，无法原位直接观察试管、培养皿中的培养物，包括：培养物在培养基中的自然生长状态，如基内菌丝、气生菌丝、菌丝的自然分枝角度、分生孢子分枝的形态、分生孢子的着生状态、气生菌丝老化情况、菌丝的锁状联合、菌核、厚垣孢子等；培养物中的杂菌，如细菌、霉菌黏菌等的污染状态。而使用带摄像头的生物摄影显微镜观察菌丝形态，可以直接获得图像，便于学术交流和现场教学、网络直播交流，但其价格昂贵，使用成本高。

随着智能手机的摄像功能的日益完善，有研究者尝试直接用手机镜头直接对着显微镜的目镜进行拍摄[1,2]，也有报道运用手机和三脚组合成拍照装备在显微镜下观察水雾动态视频的方法[3]。已有手机与生物显微镜连接装置的实用新型专利，如黄馨颖等[4]申请的一种显微镜用手机定位拍摄辅助装置。该装置结构由目镜固定架和显微镜镜头构成，其显微镜目镜用固定架锁紧调平后使用，解决了显微镜拍摄设备造价高、定位不准确、易抖动的问题。陈晓曦[5]发明一种智能手机与显微镜头的可拆式连接座，连接座包括与智能手机背面紧贴的贴合板，以及从贴合板两端延伸而出并包覆智能手机两侧边缘的一对夹合板，两夹合板分别设置有用于弹性夹紧智能手机正面的弹性卡指。沈明学[6]发明一种显微镜用手机镜头连接器，包括很多个调节座。邓超[7]提到制作支架用来固定手机，可以观察多台显微镜下的标本图像，提高观察效率，方便师生交流。

本文结合多年的实践经验，介绍一种用便携式支架固定手机，直接在显微镜目镜上照相，原位观察试管或培养皿中的食用菌菌丝及霉菌、细菌等的操作方法。

1 器 材

智能手机1 台，手机支架1 个，普通生物显微镜1 台，物镜放大倍数2×、4×、10×、20×、40×、100×。试管斜面培养物，培养皿培养物。

2 操作方法

2.1 试管及培养皿的放置

如图1所示，将已培养好的食用菌试管放置在显微镜的载物台上，试管斜面垂直于载物台，斜面边缘与物镜镜头中央对齐，观察培养基边缘的气生菌丝；斜面培养基背面朝上，可以观察培养基内的菌丝。用4×、10×的物镜直接原位观察菌丝形态。在不影响观察的前提下，可用其他物体将试管固定。

图1 试管斜面培养物的放置

如图2所示，培养皿背面朝上，放在载物台上，用4×、10×的物镜可以观察培养基内的菌丝体；将培养皿打开，放在载物台上，用4×、10×、20×、40×、100×的物镜可以观察菌丝和细菌的形态。

图2 培养皿的放置

2.2 构建智能手机和便携式支架的组合体

把手机固定在支架的卡槽上，有利于在后续的操作中对设备进行微调，同时防止因手的抖动造成手机聚焦困难。首先将支架放于水平桌面上，将智能手机安装固定于支架上的装载手机位置，使两者形成一个组合体。调节手机后置摄像头与水平面的角度，尽量达到两者平行。

2.3 显微镜的调节

首先调节转换器，将物镜转换成4×物镜。然后进行对焦，人眼通过目镜观察载物台上的培养物，用右手顺时针、逆时针来回转动粗准焦螺旋，直到视野中出现清晰的图像，对焦完成。对好焦后即可再次转动转换器，调至10×物镜，此时不再转动粗准焦螺旋，而是通过调节细准焦螺旋来对焦（方法同粗准的调节一致），从而将物体放大。若调节细准无果，可轻微来回转动粗准来对其进行对焦。之后用相同的步骤将物镜依次换至40×、100×，以进一步原位观察菌丝的形态。由于随着放大倍数的增大，视野中的光线会变暗，可通过适当调大光圈、调整灯源亮度和聚光器位置等方法加以解决。通过对粗调旋钮、细调旋钮及光圈、聚光器等的调整，便可在目镜内看见清晰的菌丝图像。

2.4 组合体与显微镜结合

将组合体移至显微镜的正前方，调节手机支架的高度，使手机的高度高出显微镜的目镜1～2 cm即可。打开手机的照相功能。开始调节手机摄像头与水平面的角度使手机摄像头与目镜平行，同时调节手机摄像头与目镜两者连线的距离，使手机的屏幕中可以看到一个完整且大致清晰的图像，并尽量调整到可以看见完整图形的最大值（大致为4 cm）。

2.5 手机对焦以及拍摄

双手紧贴手机支架的底部，可将其在水平面内前后左右移动，直到手机内可以大致看见菌丝体的形态。在确定好组合体和显微镜的距离，以及目镜和摄像头的距离后，轻点手机屏幕对其对焦，在可以清晰地看见菌丝体结构后，开始照相。也可在调节好后，再微调细准焦螺旋，使手机内的图像更为清晰。

2.6 单根菌丝生长动态的拍摄

先把培养皿打开，将培养物放在载物台上，调节显微镜粗、细调节旋钮，选择菌落边缘的单根菌丝放在视野的最边缘，用透明胶带固定培养皿在载物台上的位置。将手机和支架组合体放在目镜上方合适的位置进行拍照。针对不同生长速度的物种，每间隔1 小时或数小时定时拍照。最后把采集到的图片用动画软件编辑为连续的视频。

2.7 菌丝中原生质流动的拍摄

把培养皿打开，将培养物直接放在载物台上。用40×或100×物镜观察，选择单根菌丝进行观察，如菌丝直径在5～20 μm 的羊肚菌、双孢蘑菇、毛霉、根霉等的菌丝，可以用手机拍视频，观察菌丝中原生质的流动方向和流动速度。

3 实 例

用上述方法观察拍摄到的各种食用菌菌丝及霉菌、细菌实例见图3～5。

图3 在10×物镜下原位观察到的毛霉菌丝和被细菌污染的羊肚菌菌丝

图4 在100×物镜下原位观察到的羊肚菌菌丝与杆状细菌

图5 在100×物镜下原位观察到的羊肚菌菌丝

4 注意事项

由于目前大部分智能手机的后置摄像头有2～3 个或以上，在拍照之前应进行初试，找出成像最清楚的那一个再进入后续操作。手机的后置摄像头应与目镜靠近但不完全与其接触，要保持一定距离。在点击手机屏幕以及拍照时应轻点，否则可能会导致支架剧烈晃动而难以聚焦，也可以选择质量大的金属支架予以避免。

原位观察试管中的菌丝，最好用一个重物放在载物台外侧，挡住试管，以免试管滚落摔破。最好使用15×150（mm）规格的试管，其放在十字推进器上可以左右移动，便于用4×、10×物镜直接观察。使用18×180（mm）试管，放在十字推进器上无法聚焦，而直接放在载物台上观察，又不便于固定和移动，观察较困难；使用20×200（mm）的试管也很难直接观察。使用玻璃、聚丙烯材质的培养皿直接观察，效果都很好。

在目镜中放入目镜测微尺，对培养皿中的单根菌丝进行定位、定时测量，可以测定菌丝的生长速度。

试管、培养皿中的培养基应使用透明度高的培养基配方，最好使用质量较好的琼脂粉。培养皿中的培养基厚度一般不要超过2 mm。