林 源，郑金宇,，马小虎，杨 林，梁 彤，王 锐,杨延辉

抗体偶联药物(ADC)是通过连接子技术将具有靶向性的抗体与具有生物活性的药物相结合的一种偶联物，使药物获得了靶向性，从而可以靶向到特定的组织或细胞后再释放出药物发挥作用[1]。ADC药物多以针对肿瘤细胞为靶点的抗肿瘤药物[2-4]。2000年，FDA批准了首个ADC药物Mylotarg，用于治疗急性髓性白血病患者。截至2018年，FDA批准了4种抗癌抗体偶联药物，分别针对急性粒细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、HER2阳性乳腺癌、急性髓性白血病4种疾病，而全球有超过85个ADC新药处于临床试验的不同阶段[5-7]。ADC药物成功与否取决于靶点、抗体、细胞毒素、连接物4个方面。其中，将具有靶向性的抗体与细胞毒素连接起来的技术，是构建ADC的关键环节。细胞毒素通过连接子可以连接到抗体IgG表面的赖氨酸残基，或连接到铰链区二硫键还原后形成的半胱氨酸。此外，还可通过在抗体特定位点引入半胱氨酸或非天然氨基酸实现毒素的定点偶联[8-10]。偶联后的ADC需要检验其偶联效率和药物抗体偶联比，最后验证其在体内的药代动力学及生物活性。目前，检测ADC偶联效率和药物抗体偶联比(DAR)的方法主要有紫外分光光度法、疏水作用色谱、反相高效液相色谱、液相色谱偶联电喷雾离子化质谱、成像毛细管等电聚焦法等[11-15]。本实验我们尝试将IgG与小分子毒性药物DM1进行偶联，构建了IgG-SMCC-DM1，并通过全波长酶标仪微量测定板进行紫外光谱验证，旨在建立一种可在常规生物学实验室评估ADC偶联率的微量检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料：人IgG干粉(上海生工生物，D110501)，SMCC选用磺基修饰的Sulfo-SMCC(Thermo Fisher，22322)，DM1美登素(武汉德美凯)，DMA(N,N-二甲基乙酰胺,sigma，271012)，Sephadex G25脱盐柱(无锡天演生物技术有限公司，PC DS-A3)。

1.2 实验仪器：全波长酶标仪(Thermo multiskan go，μdropTMPlate)。

1.3 缓冲液：缓冲液A,含50 mmol/L磷酸钾、50 mmol/L氯化钠、2 mmol/L EDTA、pH 6.5的磷酸盐缓冲液。偶联缓冲液：含100 mM 磷酸钠和150 mM 氯化钠及pH为7.2的磷酸盐缓冲液。

1.4 实验方法

1.4.1 采用两步法构建IgG-SMCC-DM1：①将IgG与SMCC偶联构建IgG-SMCC，用50 mM磷酸钠缓冲液溶解亲水性连接子SMCC，使SMCC溶液浓度为20 mmol/L。用50 mM磷酸盐缓冲液配制浓度为10 mg/mL IgG溶液，搅拌IgG溶液，缓慢加入5%浓度的DMA，然后加入等量体积SMCC溶液，使IgG与SMCC的摩尔浓度之比为1:7.5。搅拌状态下，室温反应2 h。反应溶液用Sephadex G25脱盐树脂进行过滤，除去过量反应物及反应副产物，用缓冲液A做洗脱液收集IgG-SMCC溶液。②引入DM1构建IgG-SMCC-DM1，将DM1溶解于DMA中至浓度5 mmol/L。用50 mM磷酸盐缓冲液将IgG-SMCC溶液的浓度稀释至10 mg/mL，缓慢添加5%浓度的DMA。在搅拌状态下，缓慢加入DM1溶液，使连接子与其摩尔浓度为1∶3，使反应体系中IgG的终浓度为5 mg/mL，室温反应20 h。反应液经脱盐树脂Sephadex G25 进行过滤，收集洗脱样品用于检测。

1.4.2 紫外分光光度法检测样品的吸收光谱：打开全波长酶标仪，设置波长204～320 nm，在μdropTMplate上滴加检测样品2 μl，置于酶标仪中检测。空白组为偶联缓冲液，单一组分样品为用偶联缓冲液溶解的IgG(10 mg/mL)、SMCC溶液(20 mmol/L)、DM1(5 mmol/L)；双组分样品为单一组分样品的混合液，包括：IgG与SMCC 1∶1体积混合液、SMCC与DM1 1∶1体积混合液、IgG与DM 11∶1体积混合液；偶联抗体组为纯化后收集的样品。

2 结果

2.1 IgG和DM1单一组分样本检测：为了检测单一成分在紫外波长范围的吸光值，选取240～320 nm紫外波长范围进行了检测，结果显示空白组偶联缓冲液和SMCC溶液在240～320 nm波长范围无最大吸收峰，单一的DM1溶液在253 nm处有最大吸收峰，而单一的IgG溶液则在278 nm处有最大吸收峰。

2.2 IgG和DM1混合组分样本检测：为了解同一体系中的单一组分是否影响另一组分的吸光值，检测了不同混合样本在240～320 nm的紫外吸光值。结果显示SMCC对IgG最大吸收峰的出峰时间有影响，会使IgG的出峰时间由278 nm提前至274 nm；而SMCC对DM1的出峰时间无影响，IgG与DM1相互之间也不影响各自的出峰时间，而同时混合IgG、SMCC、DM1组分不影响DM1与IgG的出峰时间。

2.3 IgG-SMCC-DM1偶联物检测：偶联后的IgG-SMCC-DM1溶液经脱盐树脂Sephadex G25后，共收集了20管样品，每管约1.5 mL。经紫外吸光值检测，结果显示洗脱前期1～3管为缓冲液成分，曲线平缓，无吸收峰出现；当收集到第4管时，开始在280 nm处出现IgG的吸收峰，此时被洗脱下来的是未结合DM1的IgG或IgG-SMCC；洗脱中期，第5～11管的样品在252和280 nm 处均有吸收峰，表明此时有IgG-SMCC-DM1被洗脱下来，DM1由于Sephadex G25的分子筛作用不会过早地被洗脱下来；洗脱后期，在第12管之后的样品只在252 nm处有DM1的吸收峰。

3 讨论

本实验显示，DM1溶液在253 nm处有最大吸收峰、IgG在278 nm处有最大吸收峰，而Laurent Ducry的文献中DM1的最大吸收峰是252 nm，IgG的最大吸收峰是280 nm[1,11]。我们认为同一物质的出峰时间会受多个因素的影响而略有差异，这些因素包括不同溶解体系(缓冲液和抗体类型不同)和不同测试环境(测试样本量和测试仪器不同)。

为了测试同一体系中其他成分对DM1和IgG吸收峰的影响，检测了4种不同成分样本的紫外吸光值，结果显示SMCC会使IgG的吸收峰的出峰波长提前，因为IgG能与SMCC结合形成IgG-SMCC，推测快速形成的IgG-SMCC是IgG吸收峰改变的原因，其具体机制仍需要进一步进行分析。其它各组分混合后不影响DM1和IgG的出峰波长，但吸光值会随混入的物质浓度而相应的增加。

检测ADC偶联效率和药物抗体偶联比的方法中，疏水作用色谱、反相高效液相色谱、液相色谱偶联电喷雾离子化质谱、成像毛细管等电聚焦法等均需用到相应的大型仪器设备及专门用来分离大分子蛋白质的色谱柱上。而通常情况下，分子生物学实验室缺乏这些设备，不能迅速对ADC偶联效率进行鉴定。如果选用紫外光谱法检测ADC药物，使用的紫外分光光度计或酶标仪则较为常见[16-17]。在本实验中使用全波长酶标仪的微量测定板μdropTMplate检测，可以准确地检测出小样本量(2 μl)中的抗体偶联物。

IgG-SMCC-DM1的构建共有2次纯化。第一次纯化为IgG与SMCC偶联后的纯化，能够除去未结合的SMCC；而第二次纯化为IgG-SMCC与DM1偶联后的纯化，能够除去未结合DM1。通过对纯化IgG-SMCC-DM1样品进行紫外光谱分析，可初步判断IgG-SMCC-DM1的质量，成功偶联DM1的IgG在253～278 nm处都出峰，而没有偶联DM1的IgG和IgG-SMCC则只有253 nm处一个峰。

需要注意的是，要避免偶联时DM1的使用过量，以免在纯化样品过柱时速度缓慢，以及DM1过早洗脱下来影响IgG-SMCC-DM1的回收。尽管紫外分光光度计实现了微量检测抗体偶联药物IgG-SMCC-DM1的作用，但是由于没有直接检测数据证明各成分间的正确连接，需要进一步用疏水作用色谱仪、HPLC等精密检测仪器进行验证。