田辉，王帅，刘波

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类通常被认为安全的（generally recognized as safe，GARS）革兰氏阳性菌，因其具有培养条件简单、分泌系统良好、不含内毒素等特点，广泛用于食品加工、药物研制、工程酶生产等方面[1−2]。B.subtilis168于1997年完成全基因组测序[3]，为从分子水平上研究B.subtilis提供了可靠的信息平台。便捷的遗传转化体系是实现B.subtilis基因操作技术的关键，目前，B.subtilis主要的转化方法包括以下几种方法。①原生质体转化法[4]。原生质体是在溶菌酶作用下芽孢杆菌消除细胞壁后的细胞，在聚乙二醇（polyethylene glycol）介导下，促进细胞膜对外源DNA的吸附，进而完成转化；②自然感受态法[5]。通过控制芽孢杆菌的培养条件，将枯草芽孢杆菌从营养丰富的培养基中转接至营养贫瘠的培养基中，生长到特定的生长阶段，形成感受态；③电击转化法[6]。在瞬时的电脉冲下，菌体上形成小孔，使DNA分子进入。这些方法普遍流程繁琐，对操作技术要求极高，难以大面积推广。

芽孢杆菌的自然感受态是细胞易于吸收外源DNA的一个特定理化状态[7]，主要由ComX和CSF信息素组成的菌体密度感应网络介导[8−10]，其中ComK是一个全局调控因子，能激活晚期感受态形成相关基因的表达，主要包括ComC、ComE、ComF等DNA转运蛋白，参与DNA断裂降解过程的核酸酶NucA以及重组交换相关的蛋白RecA、AddB等[11−12]，comK仅在严格的培养环境以及菌体生长阶段才开始转录[13]，当ComK在胞内达到一定的阈值时，细胞即成为感受态。因此，comK的定量表达是细胞自然感受态形成的关键，并在……