胡勇，杨俭，邱波

武汉大学人民医院骨科，武汉430060

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的慢性骨关节病，也是引起中老年人关节疼痛及功能丧失最主要的原因。研究显示，65岁以上的人群OA患者占50%，随着我国人口老龄化逐渐加剧，OA发病率也呈逐渐上升的趋势，造成了严重的社会和经济负担[1]。因此，深入了解并干预OA发病机制，可缓解OA的病理损伤反应，减轻社会和经济负担，提高患者生活质量，并可为有效防治OA提供新的策略。

近年来，人们认识到OA并非简单的软骨磨损，而是炎症因子驱动的关节内组织的异常重塑[2]。炎症反应驱动了OA病理变化的发生及发展，并且抗炎症反应治疗已在OA动物模型上取得成效[3]。作为代表性炎症因子，半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）在OA关节腔表现为高表达和高分泌，能抑制软骨下骨基质主要成分Ⅰ型胶原α1链的表达，向小鼠关节腔内注射Gal-3会引起关节OA样病变[4]。在OA进程早期，软骨下骨重塑率增加，骨量减少，而在OA晚期，作为成骨细胞终末分化标志的骨钙素（osteocalcin）表达增加，虽然软骨下骨板增厚，骨体积增加，但由于低矿化而导致骨质量下降[5]。同时，OA中骨髓水肿，静脉阻塞和淤滞，软骨下血管中微栓塞的形成均会导致血流减少，引发缺血，进而在软骨下骨中产生正常氧环境和缺氧环境的循环[6−7]。提示氧环境的差异可能影响OA中的软骨下骨重塑，而Gal-3在不同氧环境下如何作用于软骨下骨尚无相关报道。软骨下骨的代谢紊乱和炎症反应会导致OA的疾病进展，本研究探讨了Gal-3在正常氧条件和缺氧条件下OA软骨下骨异常矿化中的作用，旨在为OA治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 患者临床资料及标本获取

选取就诊于武汉大学人民医院骨关节外科患者18例，其中女性12例，男性6例，平均年龄68.4岁，平均体重指数31.7 kg·m−2。患者自愿签署知情同意书后，均于行全膝关节置换时获取软骨下骨（胫骨平台）标本。根据美国风湿病学会公认的临床标准[8]，所有OA患者均经风湿病学专家确诊。研究经武汉大学人民医院科研伦理委员会审核批准。

1.2 软骨下骨成骨细胞培养及处理

去除胫骨平台表面的软骨，并取软骨下骨骨板进行分割，制备成骨细胞[9−10]。当成骨细胞铺满后，传代1次，培养5 d后，分别在正常氧（21%O2）和 缺 氧（0.5% O2）条 件 下 给 予Gal-3（R&D Systems，美国）5 μg·mL−1处理24 h。

1.3 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）

收集已处理完成的细胞，应用TRizol（Qiagen，德国）提取总RNA，应用逆转录试剂盒Taqman RT试剂（赛默飞，美国）将RNA逆转录为cDNA。设计骨钙素、ERRα基因、sirtuin1基因的qRT-PCR引物（赛默飞，美国），应用荧光定量试剂盒检测mRNA表达量，RP29作为参照基因，采用2−ΔΔCt法计算相对表达量。基因特异性引物对见表1所示。

1.4 Gal-3对OA成骨细胞矿化作用的影响

将一代成骨细胞均匀铺种于12孔培养板，使用矿化培养液（常规培养基+50 μg·mL−1抗坏血酸+50 μg·mL−1β-甘油磷酸）进行培养，分别置于21% O2，5% CO2，37℃饱和湿度的培养箱中。成骨细胞每周用PBS、Gal-3（1.5 μg·mL−1）和Gal-3（5 μg·mL−1）处理2次，28 d后收集细胞并进行茜素红染色，染色后使用Olympus显微镜进行拍照。提取已染色的矿化细胞，进行矿化定量分析。

1.5 数据分析

采用SPSS 22进行数据分析，所有定量数据均以平均值±SEM表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

2 结果和分析

2.1 Gal-3对矿化相关基因表达的影响

用Gal-3处理一代成骨细胞24 h后，如图1A所示，在正常氧条件下，Gal-3抑制骨钙素表达近50%（n=7，P<0.05）。对ERRα表达无显著影响（n=6，P>0.05），尽管sirtuin1的表达也有增加的趋势，但差异无统计学意义（n=5，P>0.05）。如图1B所示，Gal-3也抑制低氧条件下骨钙素的表达，其表达率下降35%（n=7，P<0.05）。Gal-3诱导ERRα和sirtuin1表达分别增加40%（n=6，P<0.05）和60%（n=5，P<0.05）。表明Gal-3在正常氧和缺氧条件下均可抑制骨钙素的表达，但仅在缺氧条件下诱导ERRα和sirtuin1的表达。

图1 常氧和缺氧条件下Gal-3对矿化相关基因表达的影响Fig.1 Effect of Gal-3 on the expression of mineralization-related genes under normoxia and hypoxia conditions

2.2 定性评估不同浓度Gal-3对成骨细胞矿化的影响

如图2A~C所示，1.5 μg·mL−1Gal-3诱导矿化诱导的作用不明显，5 μg·mL−1明显诱导了成骨细胞矿化。在显微镜下观察，如图2D~I所示，与对照组相比，20倍（图2D~F）和100倍（图2G~I）下的图像显示，1.5 μg·mL−1Gal-3诱导成骨细胞矿化，5 μg·mL−1Gal-3延长了诱导时间，细胞矿化程度更高。结果表明，不同浓度的Gal-3均促进了成骨细胞的矿化，且高浓度的Gal-3作用更加显著。

2.3 定量评估不同浓度Gal-3对成骨细胞矿化的影响

提取上述各处理条件下的矿化色素，用光度法进行观察（波长425 nm）。在正常氧条件下，用Ctrl（PBS）、Gal-3（1.5 μg·mL−1）和Gal-3（5 μg·mL−1）处理成骨细胞。如图3所示，茜素红染色后，获得了相似的矿化趋势，但不同条件比较差异无统计学意义（n=5，P>0.05）。结果表明，虽然在定量评估下，随着Gal-3浓度的增加，成骨细胞的矿化程度呈增加的趋势，但差异无统计学意义。

3 讨论

在OA中，软骨下骨的改变主要表现为骨质硬化、骨赘形成、软骨下骨囊肿和骨髓水肿样病变。然而，尽管OA末期发生了骨硬化，但矿化程度明显降低，暗示发生了异常的骨重塑[11]。研究发现，软骨干骺端生长板中分化的软骨细胞中的Gal-3蛋白表达增加，有利于软骨细胞存活和软骨基质矿化[12]。Simon等[13]研究表明，Gal-3可能是成骨细胞控制矿化部位破骨细胞生成分子机制中的重要因素。最近的一项体外研究表明，Gal-3的缺失会导致成骨细胞分化和活性的失调，表现为相关的成骨基因表达形式的改变，并与矿化能力的降低相关[14]。以上研究结果提示，Gal-3可能在成骨细胞表型的异常改变中发挥重要作用，且导致OA末期的骨硬化和低矿化。此外，骨缺血已被证实与骨髓损伤相关，后者表现为高度低矿化硬化骨形成，并有二次血管重塑、纤维化和多重血栓形成，与局部缺氧程度一致[15]。因此，缺氧微环境可能是OA硬化骨形成的驱动因素[16]。然而，无论是在正常氧还是缺氧条件下，目前对Gal-3在OA成骨细胞异常矿化中的作用及其机制的研究较少，这一问题的解决有望为OA的治疗提供新的靶点。

本研究结果表明，Gal-3在正常氧和缺氧条件下均能抑制骨钙素的表达。作为OA成骨细胞的终末分化标志物，骨钙素抑制了骨矿化[17−18]，因此，Gal-3对骨钙素的抑制作用提示成骨细胞矿化的上调。本研究结果表明，Gal-3对骨钙素的抑制率为49%，高于前人报道的38%[4]，这可能是由于两项研究中Gal-3的浓度不同引起的。相同浓度的Gal-3在缺氧条件下对骨钙素表达的抑制率仅为35%。体外研究表明，慢性缺氧抑制成骨细胞矿化和骨结节的形成[19]。因此，缺氧状态可能具有对抗Gal-3对骨钙素的抑制作用，导致骨结节破坏形成。

此外，Gal-3在缺氧条件下可显著诱导ERRα和sirtuin1的表达，但在正常氧浓度条件下无明显改变。据报道，ERRα与软骨的形成和维持有关，可能与共激活有关[20]，被认为是骨生物学的重要调节因子[21]。然而，在体外实验中，其是否在成骨细胞生成或抑制成骨细胞分化中发挥作用仍存在争议[20]。随着年龄的增长，在体内作为骨量的正性调节因子，成骨细胞祖细胞中sirtuin1活性的下降可能导致与年龄相关的骨量减少[22−23]。本研究结果显示，ERRα和sirtuin1在缺氧条件下在成骨中具有积极作用。然而，这种在缺氧条件下基因表达的上调是否与OA异常骨硬化有关仍需进一步探讨。

茜素红染色显示，Gal-3可诱导成骨细胞矿化，从大体形态及镜下观察中均可发现，与对照组相比，Gal-3浓度越高，成骨细胞形成的矿化结节越明显，矿化程度越高，然而，两组染色剂定量均未发现显著的差异，这可能与操作环境、提取方法等因素有关。骨钙素的表达暗示矿化的下调。因此，Gal-3矿化染色的差异与本研究中骨钙素表达的改变是一致的。虽然模拟成骨细胞矿化的缺氧条件较困难，但缺氧条件下Gal-3对骨钙素表达的抑制提示了类似的趋势，未来的工作可针对此展开。

综上所述，Gal-3可能参与了OA成骨细胞矿化异常的诱导过程，缺氧可能具有对抗这种诱导的作用。Gal-3在OA进展中的作用机制仍有待进一步研究，为今后治疗的靶点筛选提供参考。