胡梦弦 何贵新 秦伟彬 吴成强 林 琳 王明远 冯雨菲 郑国坤

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530299，电子邮箱：2836923992@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院心血管二区，南宁市 530023)

【提要】 缺血再灌注损伤作为影响冠状动脉介入术预后的常见影响因素，其严重程度与心脏功能的恢复息息相关，但目前对于该损伤尚无特别的防治手段。外泌体的出现，揭开了其新的治疗领域。外泌体由多种细胞分泌，广泛存在于各种组织细胞和体液中，对机体的内环境稳态具有调节作用，能够通过调控各种因子改善受损的心肌细胞，对恢复心脏功能具有重要的作用。本文通过外泌体对心肌组织缺血再灌注损伤后心肌细胞的修复、巨噬细胞表型的调控、心肌纤维化及新生血管的增生等方面的影响进行综述，望为心肌组织缺血再灌注损伤的治疗干预提供新的思维方向。

冠状动脉狭窄或栓塞是心肌组织缺血的主要原因之一，长期缺血将导致心肌细胞不同程度的功能代谢紊乱、损伤甚至死亡。经皮冠状动脉介入术是目前治疗冠心病的有效方式，其通过植入导管、球囊、支架等方式使狭窄或栓塞的血管再度通畅，恢复血流对心肌细胞的营养供给。但在恢复血供的同时可能会导致已受损的心肌细胞出现缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)，扩大心脏损伤的范围，加重心肌重塑，或导致心力衰竭的产生。如何规避或降低该损伤对提高手术疗效具有重要的意义。外泌体是一种可由多种细胞分泌的囊泡小体，其在机体内分布广泛，可操作性强，能够通过减轻心肌细胞炎症反应、抑制心肌纤维化、促进心肌细胞的修复及新生血管的生成等方面减轻IRI。故本文针对外泌体对心肌IRI的干预机制研究进展进行综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体简介 外泌体是一类由多种细胞分泌的，富含蛋白质、脂质、DNA及各种RNA[例如mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA) 和环状RNA]的囊泡小体，直径为30～150nm。目前公认的外泌体形成模式是：由细胞膜内陷形成多囊泡体，多囊泡体与内质网或细胞质膜融合形成一种管腔内囊泡从而释放出胞外形成外泌体。研究表明，外泌体在机体的细胞分化、免疫应答、抗原呈递等生命代谢过程中起着重要的调节作用。其作用方式可能包括：(1)外泌体直接作用于靶细胞膜表面信号分子进行信息传递交流[1]；(2)外泌体通过释放信号分子作用于靶细胞膜表面的信号受体，从而进行细胞间的信号传递[2]；(3)外泌体囊泡膜与靶细胞细胞膜识别融合后，通过外泌体内容物的转输进行信息的转运[3]。

1.2 外泌体提取方式 根据外泌体的体积、密度及表面特征性标志物，目前提取的方法可分为：(1)超速离心法，其根据外泌体的体积及密度在离心力作用、磷酸盐缓冲液冲洗等流程后收集，适用于体积较大外泌体的收集，其工艺成熟，是目前外泌体收集的常用方法。(2)密度梯度离心法，是一种较超速离心法更为严格、纯度更高的一种提取方式，通常将待分离溶液滴入至不同溶度梯度的蔗糖等小分子溶剂中，不同密度物质间存在沉降系数差，在离心力的作用下各物质以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带[4]。(3)超滤法，是一种根据外泌体体积进行分离的方法，其原理是利用半透膜的微孔结构，在一定外界推动力的作用下将外泌体选择性回收；该方法的缺点是较大的囊泡和蛋白质被滤膜吸附，可能导致滤孔堵塞，影响外泌体的收集[5]。(4)免疫磁珠法，是运用核—壳的合成方法合成内含超顺磁性物质、外裹特异性表面标记物的高分子免疫磁珠，这些免疫磁珠能结合相应的外泌体，在外加磁场的吸引下可做定向移动。

2 心肌细胞IRI的机制

IRI的发生涉及多种复杂的机制。目前，已知的机制包括：(1)氧化自由基增多。缺血心肌区域内的氧化自由基显著增多，其能攻击细胞及细胞内各种生物膜成分中的不饱和脂肪酸，破坏膜的完整及通透性、提高生物膜流动性，导致细胞水肿，细胞质疏松及细胞顺应性降低。(2)线粒体稳态失衡。线粒体功能正常是减少IRI的关键因素。当心肌细胞发生再灌注损伤后，细胞内能量失衡，心肌细胞氧化应激和(或)三磷酸腺苷耗尽，随后线粒体钙负荷达到病理高水平，诱导线粒体内膜渗透率过渡孔开放，各种因子流入线粒体内，使得线粒体肿胀进而导致三磷酸腺苷的产生减少，细胞迅速死亡[6]。另一方面，来源于线粒体的超氧化物阴离子大量产生，负调节细胞内的抗氧化物，从而导致细胞损伤加重[7]。(3)钙离子超载。Ca2+作为维持细胞内环境稳态的第二信使，在IRI发生时，由于心肌细胞膜上的Ca2+通道相关酶的活性降低，导致细胞内Ca2+浓度升高，激活磷脂酶进而溶解细胞内的生物膜，最终使得心肌细胞损伤或凋亡[8]。(4)炎症反应。缺血再灌注诱导的炎症在心肌细胞损伤和心功能障碍中起重要作用[9]。心肌缺血再灌注能诱导核因子κB信号通路的激活以及淋巴细胞分泌的细胞因子表达。而细胞因子可直接诱导心肌细胞凋亡，淋巴细胞可进一步加重心脏损伤。

3 外泌体对心肌IRI的影响

3.1 外泌体对巨噬细胞的作用 当发生IRI时，心肌细胞启动凋亡程序，外周血管中的单核细胞逐渐向炎症区域募集，在各种促分化因子的作用下，分别转化成M1、M2型巨噬细胞，发挥促炎或抗炎等作用。研究表明，在急性心肌梗死出现后的3 d内，M1型巨噬细胞大量增加，在第3天达到高峰，且白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-8等细胞因子水平增高；在3 d后，M2型巨噬细胞数量逐渐增加，在5～7 d时，M1型巨噬细胞逐渐被M2型巨噬细胞所代替，且促进愈合因子水平增高，如成纤维生长因子及细胞因子IL-10等[10]。此外，在心肌损伤的同时，血液循环中的单核细胞被招募至受损心肌组织，取代原有的M2型巨噬细胞，然后分化为具有诊断性意义的M1型巨噬细胞，加重心肌损伤[11-12]。在心肌损伤的修复过程中，调节M2型巨噬细胞的水平确实能够减轻心肌组织的损伤范围，但不意味着要完全抑制M1型巨噬细胞的表达。Jia等[13]发现，完全抑制心肌组织中M1型巨噬细胞的表达并不能有效减轻心肌细胞的纤维化，而通过增加M2型巨噬细胞的数量，并减少M1型巨噬细胞数量，才能够有效减轻小鼠心肌纤维化程度。因此，促进M2型巨噬细胞的产生对减轻心肌纤维化水平、降低IRI的严重程度具有重要的意义。外泌体作为一类由多种细胞分泌的囊泡物质，能够调节巨噬细胞的功能，减轻炎症反应。有学者将来源于人脐带间充质干细胞的外泌体与单核巨噬细胞共培养，发现外泌体能够有效促进单核巨噬细胞的增长，在一定水平上抑制M1型巨噬细胞的表达，并促进单核巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，同时可提高IL-10的表达水平，而降低炎性因子IL-8、IL-12的分泌水平，且这种作用效果与外泌体的溶度呈正比[14]。这对减轻心肌细胞炎症、缓解IRI具有重要作用。

3.2 外泌体对心肌纤维化的抑制作用 当炎症因子被抑制后，促纤维化信号增强，心肌组织进入纤维增殖期。成纤维细胞和肌成纤维细胞在心肌纤维化的形成中发挥着主要作用，正常的心肌组织中不存在肌成纤维细胞，当心肌纤维化开始时，成纤维细胞在信号因子的作用下大量增殖并转化为肌成纤维细胞。心脏组织的纤维增殖期可分为两大过程，即修复性纤维化(梗死区心肌重塑)和反应性纤维化(非梗死区心室壁重塑)。修复性心肌纤维化对于维持心室的功能、保护心脏的完整性至关重要，但过度的心肌纤维化将引起心室收缩力进行性下降，甚至导致心力衰竭的发生。因此，控制肌成纤维细胞水平对减少心肌瘢痕组织至关重要。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是多效性细胞因子，对肌成纤维细胞的形成具有促进作用，研究表明,外泌体源性miRNA-425和miRNA-744能够抑制TGF-β受体蛋白的表达而减少肌纤维的表达，从而抑制心肌纤维化[15-16]。方硕[17]通过对脐带间充质干细胞来源的外泌体的蛋白质和核酸进行裂解，发现外泌体的核酸成分是抑制心肌细胞纤维化的主要物质，且核酸的主要成分是miRNA；在进一步的实验中，其发现miRNA-23a和miRNA-125b通过抑制TGF-β/Smad通路来减少肌成纤维细胞的形成。研究显示，miRNA-133a通过调节TGF-β1和CTGF的表达水平来抑制心肌纤维化，而转染miRNA-133a的心房组织TGF-β1和CTGF的表达水平下降，而敲除miRNA-133a的成纤维细胞和心肌细胞中CTGF的表达水平上升，心肌纤维化水平也随之改变[18-19]。由此可见，外泌体或通过miRNA抑制心肌细胞纤维化，从而减轻IRI的严重程度。

3.3 外泌体对受损心肌的修复作用 冠状动脉狭窄导致心肌细胞长期处于缺血状态，当支架植入后心肌组织恢复血供将会使心肌细胞发生IRI，如何将IRI降至最低是减少经皮冠状动脉介入治疗后遗症的关键，而外泌体作为修复受损心肌的“治疗剂”发挥着至关重要的作用。产进中等[20]发现，对大鼠心脏进行缺血预处理后，其血清外泌体含量明显高于未经缺血预处理的大鼠，此外在IRI发生前将外泌体注入模型鼠静脉内可使得心肌梗死面积显著减少。心肌球源性干细胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 是一类可以促进心肌细胞再生的心肌来源球细胞，研究表明，CDC分泌的外泌体可以复制CDC的心脏保护和再生作用[21]，能够有效地抑制心肌细胞的凋亡[22]。 Gallet等[23]发现，在急性心肌梗死和慢性心肌梗死的猪模型中，将来源于CDC的外泌体注射到梗死的心肌内可明显减轻IRI，提高左心室射血分数，并抑制心脏不良重塑。Xiao等[24]对心脏祖细胞进行氧化应激处理后发现，与正常细胞相比，心脏祖细胞能够分泌更多的外泌体，并且外泌体中miRNA-21表达水平显著提高，能够通过恢复miRNA-21/程序性细胞死亡-4通路阻止心肌细胞发生氧化应激相关性凋亡。

3.4 外泌体对新生微血管形成的促进作用 促进新生微血管的形成是外泌体的一项重要功能，其包括促进微血管的生成和增殖。这些作用与外泌体的分化、迁移以及原有存在于血管中的外泌体有关。 Arslan等[25]发现，来自间充质干细胞的外泌体可以通过激活促生长因子信号，一定程度上恢复受损细胞的生物活性，并且减轻氧化应激反应，从而提高心肌活力，抑制心肌IRI后的不良重构。同样有研究显示，由间充质干细胞分泌的外泌体在微血管内内化后，对血管的生成及增殖和心肌细胞的修复发挥重要的作用[26]。研究表明，将来自间充质干细胞的外泌体注射到卒中大鼠体内，可以通过促进血管生成、神经突重塑和神经细胞新生来缓解症状[27]。此外，在缺氧条件下来源于脐带间充质干细胞的外泌体不仅能够促进脐带血管内皮细胞的增生和毛细血管的生成，还丰富了脐带毛细血管网，使得血流得以恢复[28]。还有研究表明，心脏祖细胞释放的外泌体可通过促进内皮细胞迁移和血管内皮生长因子的分泌，诱导心肌组织和血管的再生，从而显著改善心脏功能[29-30]。

4 小结与展望

心肌IRI是心梗后不可避免的病理过程，可造成心肌组织微循环障碍和细胞氧化应激损伤。外泌体作为由多种细胞分泌的囊泡小体，携带各种生物信号分子，其利用表面特异性膜蛋白与特定靶细胞结合，完成细胞间生物信号的特异性传递。目前大量研究表明外泌体能够通过抑制炎症反应减少心肌细胞受损，调节心肌纤维化、减低心脏瘢痕面积和促进新生血管的形成以改善心脏微循环。因此，以外泌体为研究靶点更深入地研究心肌IRI对心肌梗死患者的预后具有重要的意义。