张之浩, 李威, 吴晓芙

1.长沙环境保护职业技术学院 2.中南林业科技大学生命科学与技术学院

无需转移水体而直接在原位进行生态治理的原位生态修复技术，因其高效益低成本的优势而得以在污染水体修复的众多方法中备受关注[1]。其中富营养化水体治理是污水原位生态修复的关键环节[2-5]。富营养化水体中优势藻类如蓝绿藻的爆发增长是造成污染进一步加剧的原因[6-7]，而沉水植物在生长过程中可以通过释放一些化感物质直接或间接影响藻类的生长[8-11]，沉水植物的根、茎、叶均能吸收和富集水体中的营养元素，在通过根部释放氧气增加水中含氧量的同时改善好氧生物的生长环境进而影响污染物的生物降解过程，达到水质净化、水环境改善、系统稳定性得以提升的效应[12-14]。

目前的研究多集中于探明挺水植物在污染水体原位生态修复中的功效与机理[15]，而聚焦于沉水植物抑藻效应的研究较少，已有的报道也多仅限于关注单一沉水植物的抑藻作用与机理研究。由于实际水体中污染情况复杂多样、不具统一性，且污染水体中优势藻类种类较多，加之沉水植物的生长易受外界环境因素的影响[16]，故沉水植物的抑藻作用也因植物种类的不同而有所差异。此外，化感物质的抑藻周期有限，故而在实际水体修复中应用单一沉水植物对藻类进行抑制的效果不佳，难以进行持续且稳定的水体修复。1949年Hasler等[17]首次发现水生植物的抑藻现象，此后便引发了植物抑藻作用的研究热潮。当前的研究普遍认为抑藻作用是由植物分泌的化感物质实现的，研究者也顺利从狐尾藻、金鱼藻、凤眼莲、芦苇、苦草等水生植物的水培液中提取出多种化感抑藻物质，并证实了其抑藻作用[18-19]。作为植物的分泌产物，化感物质是联系生物与环境的纽带，植物化感物质对周围环境的影响是环境生态领域的研究热点，在相关研究中已有不少化感物质被分离提纯出来[20]。

笔者选取狐尾藻、苦草、黑藻、金鱼藻和伊乐藻5种沉水植物，通过对各沉水植物的水培液进行物质结构的鉴定分析，对各水培液中化感抑藻物质进行定性、定量分析，进而探明不同种类化感物质抑藻的作用机理，以期为后续研发高效抑藻剂进而加强污染水体原位生态修复的效果提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 沉水植物水培液样本

在5个半径30 cm，深40 cm的干净水缸中加入15 L Hoagland(0.25×)营养液，选取根、茎、叶完整且叶色正常，长势较好的狐尾藻、苦草、伊乐藻、黑藻和金鱼藻5种沉水植物各150 g(鲜质量)放入水缸中，各沉水植物的生物量为10 g/L。将水缸放置在阳光棚(15～25 ℃)中进行为期10 d的沉水植物培养。沉水植物在培养前需用蒸馏水反复冲洗以去除植株上的附着物，每次冲洗时间至少达10 min[21]。

1.2 水培液的浓缩提取

选用循环水式真空泵(上海予华)及玻璃纤维膜对5种沉水植物的水培液(各10 L)进行抽滤，调节滤液pH为2～3，将滤液过waters Oasia HLB固相萃取小柱(500 mg，6 cm，GILSON固相萃取仪，使用前需用甲醇和水进行活化)，每个小柱富集1 L水后用甲醇溶液进行洗脱，合并所有洗脱液于旋转蒸发仪蒸至近干，再用250 mL超纯水进行溶解，用2 mol/L NaOH调节溶液pH到12。配置50 mL的正己烷和乙酸乙酯(体积比为1∶1)萃取试剂，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥后再于旋转蒸发仪蒸至近1 mL，经滤膜过滤后备用。

1.3 GC-MS测定与数据处理

采用GC-MS(岛津GC-MS QP2010plus串联质谱仪)来同步检出提取液中存在的包括有机酸类、醇类、酚类、醛类和酯类等物质种类和含量，毛细管色谱柱为HP-5ms(60 m×0.25 mm×0.25 mm)，用全扫描模式进行定性分析，载气为氦气，流速为1.0 mL/min，不分流进样，进样量1 μL。色谱分析条件如下：进样口温度280 ℃，初始温度60 ℃(1 min)，以8 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。MS条件如下：EI离子源，温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子能量70 eV，质谱扫描范围50～450 amu。选用其内置的GC-MS再解析程序对数据进行分析处理，样品各组分采用峰面积归一化法定量，参照NIST05及NIST05s标准谱库鉴定各组分的化学结构。

2 结果与分析

2.1 狐尾藻水培液中化感物质的测定

狐尾藻水培液检出成分色谱图及检出成分信息如表1所示。由表1可见，狐尾藻水培液共有16种有机化合物的匹配度超过70%，其中鉴定出的有机酸类物质有6种，含量占比为4.71%；醇和酚类物质共5种，含量占比为2.06%；酮和酯类物质有5种，含量占比为2.65%。其中匹配度在90%及以上的有乙酰丙酸(95%)、2-乙基己酸(97%)、癸二酸(96%)、α-甲基苯乙醇(92%)、2-乙基己醇(98%)和2,2-二甲基辛醇(97%)。检出含量占比较大的有机酸类为琥珀酸(2.36%)，醇和酚类为α-甲基苯乙醇(0.56%)，酮和酯类为2-羟乙基甲酸酯(1.13%)。

表1 狐尾藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液中的主要成分Table 1 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Myriophyllum verticillatum hydroponic solution

2.2 苦草水培液中化感物质的检测

苦草水培液检出成分色谱图及检出成分信息如表2所示。由表2可见，共有18种有机化合物的匹配度超过70%。其中鉴定出的有机酸类物质有10种，含量占比为2.66%；醇和酚类物质有5种，含量占比为1.02%；酮和酯类物质有3种，含量占比为0.70%。其中匹配度在90%及以上的有琥珀酸(96%)、乳酸(94%)、2-甲基-2,4-戊二醇(94%)和1-己酮(97%)。检出含量占比较大的有机酸类为癸酸(0.6%)、乌头酸(0.46%)，醇类为2-乙基己醇(0.31%)，酯类为邻苯二甲酸二异辛酯(0.32%)。

表2 苦草水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 2 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Vallisneria natans hydroponic solution

2.3 伊乐藻水培液中化感物质的测定

伊乐藻水培液检出成分色谱图及检出成分信息如表3所示。由表3可见，共有12种有机化合物的匹配度超过70%。其中鉴定出的有机酸类物质有8种，含量占比为3.64%；酚类物质有1种，含量占比为0.13%；酯类物质有3种，含量占比为1.19%。其中匹配度在90%及以上的有甲基丁二酸酐(92%)、对羟基苯甲酸(93%)、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(91%)和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(99%)。检出含量占比较大的有机酸类为三乙基乙酸(0.75%)、壬二酸(0.73%)和反式阿魏酸(0.71%)，酯类为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(0.83%)。

表3 伊乐藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 3 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Elodea Canadensis hydroponic solution

2.4 黑藻水培液中化感物质的测定

黑藻水培液检出成分色谱图及检出成分信息如表4所示。由表4可见，共有13种有机化合物的匹配度超过70%。其中鉴定出的有机酸类物质有10种，含量占比为7.14%；醇类物质有2种，含量占比为2.7%；酯类物质有1种，含量占比为0.68%。其中匹配度在90%及以上的有乙酰丙酸(91%)、壬酸(97%)和苯甲酸(92%)，检出含量占比较大的有机酸类为反式乌头酸(1.21%)和甲基丁二酸酐(1.09%)，醇类为苯乙醇(1.77%)。

表4 黑藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 4 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Hydrilla verticillata hydroponic solution

2.5 金鱼藻水培液中化感物质的测定

金鱼藻水培液检出成分色谱图及检出成分信息如表5所示。由表5可见，共有15种有机化合物的匹配度超过70%。其中鉴定出的有机酸类物质有5种，含量占比为1.51%；烃类物质有1种，含量占比为0.21%；醇类物质有4种，含量占比为2.15%；酮和酯类物质有5种，含量占比为9.79%。其中匹配度在90%及以上的有正丁醇(95%)、2-乙基己醇(93%)、环己酮(97%)、2-羟乙基甲酸酯(98%)、邻苯二甲酸二异丁酯(96%)和己二酸二(2-乙基己)酯(91%)。检出含量占比较大的有机酸类为癸酸(0.44%)和对羟基苯乙酸(0.43%)，醇类为α-甲基苯乙醇(0.70%)，酯类为2-羟乙基甲酸酯(5.24%)。

表5 金鱼藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 5 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Ceratophyllum demersum hydroponic solution

3 讨论

3.1 5种沉水植物水培液的成分比较分析

在5种沉水植物的水培液中共检出56种化合物，主要为有机酸类、酯类、醇类化合物及少量酚类、酮类物质。其中按各水培液中检出的化合物数量排序，表现为苦草(18)>狐尾藻(16)>金鱼藻(15)>黑藻(13)>伊乐藻(12)。狐尾藻、苦草、伊乐藻和黑藻分泌的有机酸类物质含量占比高于其他检出物质，而金鱼藻的水培液检出物中酮和酯类物质含量占比较高。

3.2 5种沉水植物化感抑藻效果分析

笔者在之前的研究中[3,21]将5种沉水植物种植于自然环境的富营养化水体中(优势藻类为绿藻和硅藻)，对比研究了狐尾藻、苦草、黑藻、金鱼藻和伊乐藻的化感抑藻效应，相关趋势如图1、图2所示。由图1可见，在狐尾藻、苦草、黑藻和金鱼藻4种沉水植物的种植水中，浮游藻类的叶绿素a浓度随培养时间的增加呈逐步降低的趋势，且浓度均低于对照组，表明由沉水植物释放出的化感物质可进入藻细胞内降解叶绿素a，进而导致浮游藻类的光合过程受阻，从而抑制浮游藻类的生长。从浮游藻类的抑制率来看〔图2(a)〕，除伊乐藻外，其余4种沉水植物对水中浮游藻类均有较明显的抑制作用，从抑制率的不同可证实由沉水植物分泌的次生代谢产物的种类和数量因植物种类的不同而存在差异。而由浮游藻类的相对生长速率曲线〔图2(b)〕的动态变化分析可得，金鱼藻处理下的浮游藻类的相对生长速率曲线变化波动较大,观察到浮游藻类的相对生长速率先随时间增加呈下降趋势，随后出现了上升的现象。

图1 各处理下浮游藻类叶绿素a浓度Fig.1 Chlorophyll a contents of phytoplankton under each treatment

图2 各处理下浮游藻类生长的抑制率和相对生长速率Fig.2 Inhibiting rate and relative growth rate of phytoplankton under each treatment

3.3 5种沉水植物化感抑藻物质分析

通过对5种沉水植物水培液成分进行鉴定和分析，发现各沉水植物所分泌化感物质的主要成分和可能的抑藻机理如表6所示。

表6 5种沉水植物可能的化感物质及抑藻机理Table 6 Possible allelochemicals and algal inhibition mechanisms of 5 submerged macrophytes

已有多个研究证实了有机酸类物质具有抑藻效应，亦已证明碳原子数为2～22的饱和及不饱和脂肪酸均能抑制蓝藻和绿藻活性[22]，刘晓宇等[23]从美人蕉叶片中鉴定出了32种有机酸组分，并通过试验验证了其对铜绿微囊藻的抑制作用，且不同浓度的有机酸组分对铜绿微囊藻的生长呈现出的“低促高抑”现象。张庭廷等[24]探究了17种不同脂肪酸类物质对产毒铜绿微囊藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻的抑藻作用，结果表明各脂肪酸对这3种藻类均呈现出不同程度的抑藻效应，且脂肪酸类物质的抑制作用与其物质结构相关。而该作者的另一研究[25]发现，加入对羟基苯甲酸会使铜绿微囊藻细胞膜出现肿胀现象，随着处理时间的增长细胞最终破碎溶解，进而抑制了铜绿微囊藻的生长。结合本研究中5种沉水植物水培液中鉴定出的有机酸物质进行推测，即琥珀酸、柠檬酸、乳酸、癸酸、壬酸、壬二酸、硬脂酸、月桂酸、对羟基苯甲酸、棕榈酸、阿魏酸、油酸具有一定的化感抑藻作用。虽有研究证实阿魏酸、顺式阿魏酸和顺式乌头酸具有抑藻效应，但鲜有文献对反式阿魏酸和反式乌头酸的抑藻效应进行探究，且顺反异构体的化学生理活性存在差异，故反式阿魏酸和反式乌头酸是否存在抑藻效应仍需进一步探明。检出的其他有机酸物质如乙酰丙酸和2-乙基己酸的抑藻能力也有待进一步的研究。

王立新等[26]发现用不同有机溶剂对黑藻养殖水进行萃取提纯得到的组分对铜绿微囊藻的抑制作用程度有所差异，其中乙醚提取物对藻类的抑制作用大于乙酸乙酯提取物，而石油醚提取物近乎无抑藻作用。进一步的研究发现，乙醚提取物对铜绿微囊藻的抑制率随提取物浓度的升高而增大。此外，对乙醚提取物进行GC-MS分析共鉴定出9种组分，其中3种酯类化合物(邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸丁脂2-甲基丙酯)的含量占到总提取物的60%以上。刘光涛等[27]研究了凤眼莲根系分泌的5种明确具有抑藻效应的化感物质对铜绿微囊藻和斜生栅藻的抑制作用，探究了化感物质种类、剂量和不同的藻类培养方式下抑藻作用的差异。发现低剂量的亚油酸甘油酯在藻类混合培养情况下对藻类的生长具有促进作用，而高剂量时则表现出明显的抑制倾向，当培养液中亚油酸甘油酯浓度为10 mg/L时，起初等比例培养的铜绿微囊藻和斜生栅藻的相对密度发生了改变，即斜生栅藻在混合培养液中的占比有所增加。张楠等[28]探究了棕榈酸、琥珀酸和乙酸丁酯分析纯溶剂的不同组合方式对蛋白核小球藻的抑制作用，发现3种物质组合应用情况下抑藻效应最佳。结合本研究的检测结果分析水培液中鉴定出的邻苯二甲酸二异丁酯和乙酸丁酯对抑藻作用具有一定的贡献。

张玲[29]在研究时发现采用乙醚萃取盐京九号水稻(OryzasativaL. Yanjing 9)的水稻水培液和水稻秸秆水浸液，对铜绿微囊藻的抑藻效果最佳，通过分离乙醚萃取液中的组分可鉴定出含有机酸类物质、碱性物质和中性物质及酚类物质等。高为等[30]以苯酚为例研究了酚类、醇类物质对斜生栅列藻生长的影响，发现藻浓度随苯酚浓度增大而减小，即藻类细胞受到的抑制作用随苯酚浓度的增大而加强。本研究中检测鉴定出的少量醇类和酚类物质可能也具备化感抑藻效应。

已有研究表明，植物的抑藻现象可能是受其分泌的多种化感物质的联合作用导致的。高云霓等[31]在苦草分泌物中检测鉴定出9种酚酸，并对其中6种酚酸混合后应用的抑藻效应进行了研究，发现抑藻作用随混合的酚酸种类增多而加强。张庭延等[32]研究结果也表明，对羟基甲苯酸和阿魏酸的联用对水花鱼腥藻和蛋白核小球藻的抑制均具有协同效应。本研究也在各沉水植物的不同水培液中检测鉴定出了多类化感物质，因而推测不同沉水植物分泌的多种化感物质之间的相互作用造成了最终的抑藻现象。

4 结论

(1) 共有56种化合物在水培液中被检出，其中检出最多的是有机酸类物质。共检出30种有机酸物质，含量占比为0.11%～2.36%；其中，酯类物质12种，含量占比为0.14%～5.24%；醇类物质7种，含量占比为0.07%～1.77%；酚类物质4种，含量占比为0.13%～0.39%；酮类和乙基苯类物质3种，含量占比为0.2%～1.33%。

(2) 推测狐尾藻水培液中检测鉴定出的琥珀酸、柠檬酸和苯酚为主要的化感物质，苦草水培液中的乳酸、癸酸、壬二酸、硬脂酸、月桂酸和苯酚发挥主要的抑藻作用，伊乐藻水培液中的主要化感物质为壬二酸、对羟基苯甲酸和棕榈酸，黑藻和金鱼藻水培液中发挥抑藻作用的物质为壬酸、阿魏酸和癸酸、油酸、乙酸丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯。

(3) 狐尾藻、苦草、伊乐藻和黑藻4种沉水植物的水培液中有机酸类物质的含量占比高于其他检出物质，推测有机酸类物质是起主要抑藻作用的化感物质。而金鱼藻中酯类物质的含量占比为8.49%，酯类物质在金鱼藻抑藻现象中可能发挥主要作用，有机酸类物质影响次之。沉水植物对藻类的抑制作用可能是多种化感物质联合作用的结果，但其相互作用机理仍待进一步的研究。