杨建波，刘鹏，张文兴，陈青山，邓芳芳

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

肝癌是常见的一种全球性实体恶性肿瘤[1]，具有极高的发病率以及病死率，对人类的生命健康具有严重的影响[2]，一般会有肝区疼痛、腹水、乏力等症状[3]。通常情况下，肝癌有手术、冷冻、化疗等治疗方式[5]，但由于化疗对其作用不明显，有效率较低，同时有不良反应[6]，因此，寻求新的抗癌中药至关重要。华蟾素注射液是一种具有抗肿瘤作用的中药注射液[7]，是从中华大蟾蜍皮中提取加工出来的，具有清热解毒、活血化瘀等功效[8]，可抑制肿瘤细胞生长，提高机体免疫功能，在肺癌、皮肤癌、胃癌等疾病中已有应用[9]。本研究主要探讨其对肝癌细胞的效用。

1 材料

1.1 细胞人肝癌HepG2细胞株(江阴雨汐生物科技有限公司，货号：YX-005)。

1.2 药物与试剂华蟾素注射液(安徽华润金蟾药业股份有限公司，批号：Z34020273)。胎牛血清(江苏依莱萨生物技术有限公司，批号：12676-029)；DMEM高糖培养基(北京科美生物技术有限公司，批号：12100046)；BCA蛋白定量试剂盒(上海赛默飞生物科技有限公司，批号：23221-23230)；SDS-PAGE试剂盒(上海如吉生物科技发展有限公司，货号：SJH0899)；PBS缓冲液(上海源叶生物科技有限公司，货号：R22379)；PVDF膜(上海易励医疗器械有限公司，批号：10600023)；缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司，货号：B1009-TBST)；EGF-1R、ERK、Akt一抗(美国CST公司，货号：2366T、2305T、2314T)；羊抗鼠二抗(广州天骏生物科技有限公司，货号：A11001)；CCK-8试剂(北京富龙康泰生物技术有限公司，货号：FP-M-300)；Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司，货号：3422)。

1.3 仪器CO2培养箱(上海迈瑞尔化学技术有限公司，型号：H3-6815-02)；生物安全柜(北京东南仪诚实验室设备有限公司，型号：BSC-1360A2)；通用离心机(深圳诸夏科技有限公司，型号：Sorvall ST 8)；酶标仪(济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BIOBASE-EL10B)；烘箱(北京赛欧华创科技有限公司，型号：DHG-9140A)；光学显微镜(博亚捷晶科技(北京)有限公司，型号：XTL)；高速组织捣碎机(昆明佰奥勒生物科技有限公司，型号：JX-2008)；电泳仪(北京六-仪器厂，型号：DYY-8C)；电泳槽(北京六仪器厂，型号：DYCZ-24D)；转印槽(北京六仪器厂，型号：DYCZ-40D)；低温高速离心机(湖南湘仪公司，型号：H2050R)；超低温冰箱(美国FORMA公司，型号：702)；分光光度计(上海分析仪器总厂，型号：721)；脱色摇床(上海琪特分析仪器有限公司，型号：STS-2)。

2 方法

2.1 细胞培养将人肝癌HepG2细胞在DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)中培养，置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中，当细胞生长到融合度约80%左右后，用体积分数0.25%胰蛋白酶处理1 min，消化传代培养，2 d进行一次培养基更换。

2.2 CCK-8细胞增殖实验将对数生长期的HepG2细胞用胰酶消化后，接种100 μL培养基的细胞悬液(每孔含2×103个细胞)于96孔板中，加入不同浓度华蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，100 μL培养基(含细胞及不含细胞)作为空白对照组，空白组每组设置3个复孔，将培养板在培养箱孵育适当时间(0 h、24 h、48 h)，向待测的培养板中每孔加入10 μL CCK-8试剂，在培养箱中孵育2 h，取出培养板用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)，并计算每组3个复孔的平均值，统计细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(给药组OD值-空白对照组OD值)/(空白对照组OD值-空白组OD值)×100%。

2.3 Transwell法检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力培养肝癌HepG2细胞，接种不同浓度华蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，设0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组，另设空白对照组，胰蛋白酶消化HepG2细胞后，进行细胞的收集，然后重悬细胞。Transwell上室的每孔中加入细胞悬液(200 μL)，下室的每孔中加入培养液(600 μL、含10% FBS)。置于培养箱中(37 ℃、5%CO2)孵育48 h，除去上室培养液，加入甲醛溶液(0.79 g·mL-1)，固定20 min。除去甲醛，结晶紫染色20 min，洗涤后置于烘箱中干燥，重复3次后，于光学显微镜下观察，进行细胞计数并统计分析肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

2.4 Western blot法检测细胞IGF-1R信号通路相关蛋白的表达培养肝癌HepG2细胞，接种不同浓度华蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1，0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，设为0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.21 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组，另设空白对照组，培养24 h，弃培养基，用PBS洗涤后，加入细胞裂解液裂解5 min后，于3 000 r·min-1，-4 ℃下进行离心，取上清液，以BCA 法测定蛋白总量。然后进行电泳、转膜，加入脱脂奶粉(5%)，密封1 h，TBST洗涤后加入一抗(稀释比例11 000)，4 ℃下孵育过夜，TBST洗涤后，添加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，洗涤后加显色剂显影，每组重复3次。用凝胶成像软件进行分析，计算IGF-1R、Akt、ERK的蛋白表达量。

3 结果

3.1 华蟾素对肝癌细胞增殖的影响与空白对照组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组12 h、24 h、48 h细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与0.053 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组12 h、24 h、48 h细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与0.105 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组12 h、24 h、48 h细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与0.210 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组12 h、24 h、48 h细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 华蟾素对肝癌细胞增殖的影响

3.2 华蟾素对肝癌细胞迁移的影响与空白对照组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组细胞迁移能力显著降低(P<0.05)；与0.053 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组细胞迁移能力显著降低(P<0.05)；与0.105 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组细胞迁移能力显著降低(P<0.05)；与0.210 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组细胞迁移能力显著降低(P<0.05)。见表2，图1。

表2 华蟾素对肝癌细胞迁移的影响

注：A：0.420 mg·L-1华蟾素注射液组；B：0.210 mg·L-1华蟾素注射液组；C：0.105 mg·L-1华蟾素注射液组；D：0.053 mg·L-1华蟾素注液组；E：空白对照组图1 华蟾素注射液对肝癌细胞迁移的影响(×100)

3.3 华蟾素对肝癌细胞侵袭的影响与空白对照组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组细胞侵袭能力显著降低(P<0.05)；与0.053 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组细胞侵袭能力显著降低(P<0.05)；与0.105 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组细胞侵袭能力显著降低(P<0.05)；与0.210 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组细胞侵袭能力显著降低(P<0.05)。见表3，图2。

表3 华蟾素对肝癌细胞侵袭的影响

注：A：0.420 mg·L-1华蟾素注射液组；B：0.210 mg·L-1华蟾素注射液组；C：0.105 mg·L-1华蟾素注射液组；D：0.053 mg·L-1华蟾素注液组；E：空白对照组图2 华蟾素注射液对肝癌细胞侵袭能力的影响(×100)

3.4 各组细胞中IGF-1R信号通路相关蛋白的表达情况与空白对照组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组、0.053 mg·L-1华蟾素注射液组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达显著下调(P<0.05)；与0.053 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组、0.105 mg·L-1华蟾素注射液组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达显著下调(P<0.05)；与0.105 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组、0.210 mg·L-1华蟾素注射液组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达显著下调(P<0.05)；与0.210 mg·L-1华蟾素注射液组比较，0.420 mg·L-1华蟾素注射液组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达显著下调(P<0.05)。见表4，图3。

表4 各组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达

注：A：0.420 mg·L-1华蟾素注射液组；B：0.210 mg·L-1华蟾素注射液组；C：0.105 mg·L-1华蟾素注射液组；D：0.053 mg·L-1华蟾素注射液组；E：空白对照组图3 各组细胞中IGF-1R信号通路相关蛋白的表达

4 讨论

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病机制较为复杂，饮水污染、亚硝胺类物质、黄曲霉素等都可能是其发生的原因[10]。肝癌在临床上具有进展迅速、病程短、中晚期生存期短等特点[11]，由于其确诊的延误性，往往会错失良好的手术机会[12]。肝癌对化疗药物不敏感，所以其治疗效果较差，而靶向药物对肝癌的治疗现状也未有改善[13]。华蟾素注射液是一种抗肿瘤类的重要注射液，主要来源为中华大蟾蜍皮，其中有吲哚生物碱、蟾毒灵以及脂蟾毒配基等成分[14]，具有止痛、抗病毒、促进骨髓增生等药理作用，还具有保护肝脏、抗肿瘤及提高机体免疫力等作用[15]。因此，本研究探讨华蟾素对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。

本实验以人肝癌HepG2细胞株为研究对象，培养肝癌HepG2细胞将其分为不同浓度华蟾素注射液组(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1、0.053 mg·L-1)及空白对照组。本研究结果表明，与空白对照组比较，不同浓度华蟾素注射液组肝癌细胞增殖抑制率增加，且华蟾素注射液作用时间越长、浓度越高，其对肝癌细胞增殖抑制率就越强。研究表明，华蟾素可抑制癌细胞增殖、诱导细胞凋亡[16-17]，本实验检测肝癌细胞迁移及侵袭情况发现，华蟾素能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，且其作用时间越长、浓度越高，对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制作用越明显。研究表明，华蟾素可以通过调控基质金属蛋白酶抑制人胃腺癌细胞MGC-803侵袭与迁移[18]；通过对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭等的检测发现，华蟾素可降低细胞的增殖侵袭等能力[19]，这与本研究的结果相一致。

IGF-1R信号通路的异常活动同多种肿瘤的发生进展以及耐药性紧密相关[20-22]。IGF-1R是一种胰岛素生长因子，是α2β2亚单位的四聚体，可同IGF结合[23-25]，其中α及β亚基皆由单个的mRNA 前体合成，经历糖基化、蛋白水解切割等步骤后，与半胱氨酸键交联最终形成功能性跨膜α-β复合链[26]，在肿瘤细胞的增殖侵袭以及耐药过程中发挥重要作用[27-29]。华蟾素对骨癌痛具有缓解作用，对炎性因子的释放、脊髓小胶质细胞的激活具有抑制作用[30]，还可抑制CCL2/CCR2途径的激活。本研究通过Western Blot法检测IGF-1R信号通路相关蛋白的表达发现，与空白对照组比较，不同浓度华蟾素注射液组细胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表达显著下调，提示华蟾素可能对IGF-1R信号通路有影响，且随着浓度的增加具有更强的抑制作用。提示华蟾素注射液可能是对IGF-1R信号通路产生作用，从而实现对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制。

综上，华蟾素可抑制肝癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力，其作用可能与抑制IGF-1R信号通路有关，这为肝癌治疗提供一个新思路。本研究也存在一定的局限性，本文是通过体外实验探索华蟾素对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，若要将华蟾素应用于临床治疗还需进一步的体内实验证实。