杨 敬，徐 勇，林传友

（华中科技大学同济医学院基础医学院，湖北 武汉 430030）

1918—1919年西班牙爆发了人类历史上最为严重的流感疫症，造成约5亿人感染，5千多万人死亡，直到1933年，英国科学家Smith Andenwes才第一次从人身上分离出了该病毒，并命名为H1N1。时至今日，一百多年过去了，人类与病毒的搏斗从未停止，随着医学和科学技术的发展，人类对流感病毒有了更深的认知。甲型H1N1流感病毒属正黏液病毒科，由于其RNA片段由8条独立的RNA单链组成，所以表面抗原血凝素（HA）和神经酰胺酶（NA）极易发生变异，导致新的病毒株和亚型不断形成，造成流感大流行乃至爆发[1-2]。西药因其成分的单一性、不良反应和长期使用的耐药性，限制了其临床使用范围，预防性接种疫苗效果也不够理想[3]，而中药来源丰富，作用范围广，毒副作用小，表现出独特优势。

中药复方合剂由板蓝根、黄芩、柴胡、知母、甘草、黄芪、金银花、鱼腥草等十二味中药组成，具有清热解毒、疏散风热之功效，较之单方具有多组分、多途径、多靶点的特点，因而具有更广泛的应用前景。本实验通过鸡胚法观察了中药复方合剂3种给药方式对甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）的抑制作用和对鸡胚的保护作用，以期为临床用药和中药开发提供实验依据。

1 材 料

1.1 实验动物9日龄SPF级健康鸡胚193枚，质量（52±2）g，武汉中博生物股份有限公司提供，动物许可证号：SYXK（鄂）2016-0086，实验符合医学实验动物管理委员会的要求。

1.2 药物与试剂 中药复方合剂：由板蓝根、黄芩、柴胡、知母、甘草、黄芪、金银花、鱼腥草等十二味中药组成，按传统方法蒸馏水浸泡、煎煮、合并、浓缩至100 mL，每毫升相当于1 g生药（1 g/mL），由佛山康力泰有限公司提供，高压灭菌，4℃保存备用；利巴韦林注射液（山东鲁抗辰欣药业有限公司，国药准字H20003176）；枸橼酸钠（上海试剂一厂，批号：2004-07-17）；生理盐水（武汉福星生物药业有限公司，国药准字H42022223）；1%鸡红细胞悬液：采集健康公鸡血，3.8%枸橼酸钠抗凝，生理盐水洗涤3遍后配制。

1.3 病毒株 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）由武汉大学医学院病毒所提供，在鸡胚中传代恢复活力。将保存的病毒液10-3～10-5倍稀释后，接种于9日龄鸡胚数枚，每胚0.2 mL，封孔后置35℃，每12 h照蛋观察一次，弃去24 h内死亡胚，24～96 h未死鸡胚放4℃过夜，收集尿囊液，测血凝滴度，选1∶640以上的病毒液，备用。

1.4 主要仪器SW-TFG-18型超净工作台（江苏净化设备厂）；PYX-DHS-40X50-BS-Ⅱ型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；TDZ5-WS型低速台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

2 方 法

2.1 中药复方合剂对鸡胚毒性的测定 中药复方合剂用无菌生理盐水连续对倍稀释成7个稀释度，分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，备用。常规选择生长良好的9日龄SPF鸡胚，检卵灯下观察并标记气室与胚胎的位置，2.5%碘酒及75%酒精消毒，用无菌锥子在气室旁无大血管处锥一个直径2 mm小孔，再次消毒，1 mL注射器吸取待接种的药物0.2 mL，注入尿囊腔，每个稀释度作5枚鸡胚，同步设生理盐水对照，消毒后石蜡封口，置35℃孵化箱孵育96 h，连续观察鸡胚生长发育情况，弃去24 h内死胚，以鸡胚可存活96 h的最大浓度作为药物的最大无毒限量。

2.2 鸡胚半数感染量EID50的测定 用无菌生理盐水10倍稀释A/PR/8/34（H1N1）病毒株，依次10-1～10-7各稀释度病毒，每稀释度接种5枚，0.2 mL/枚，石蜡封口，置35℃恒温箱孵育，逐日照蛋观察至96 h，弃去24 h内死亡鸡胚，死亡鸡胚放4℃冷却或过夜，收获的尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，依据Reed-Muench法进行计算[4]。

EID50=高于50%的稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

2.3 中药复方合剂对甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用

2.3.1 中药复方合剂对鸡胚的保护作用SPF级健康鸡胚随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组和中药复方合剂低、中、高剂量组，每组6枚。在药物对鸡胚安全浓度范围内，采取3种给药方式，（1）同时给药（中药和病毒液胚外混合后接种）：先将中药复方合剂0.1 mL与100EID50H1N1病毒液0.1 mL充分混合后，置35℃恒温箱孵育2 h，再接种于9日龄鸡胚尿囊腔。（2）预防给药（先接种中药后接种病毒）：先将中药复方合剂0.1 mL接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置35℃恒温箱孵育2 h，再接种0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液。（3）治疗给药（先接种病毒后接种中药）：先将0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置35℃恒温箱孵育2 h，再接种0.1 mL中药复方合剂。每组接种完后，置35℃恒温箱继续孵育至96 h，记录鸡胚的存活率和测定尿囊液血凝效价，计算血凝滴度[5]。

2.3.2 尿囊液血凝效价的测定 收集96 h后的各组鸡胚尿囊液，生理盐水稀释至1∶20～1∶64，于96孔V型板上，取稀释好的尿囊液50μL/孔，再加入1%鸡红细胞50μL/孔，漩涡器上震荡1 min，使鸡红细胞与病毒充分混合，置37℃30 min，待对照孔红细胞沉淀，即可观察结果，以“+”为终点，即能够使50%红细胞凝集的血凝素的最高稀释度作为该血凝素效价。

2.4 统计学方法Reed-Muench法计算药物对鸡胚半数感染量（EID50），数据采用SPSS 25.0统计学软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 中药复方合剂对鸡胚最大安全浓度 中药复方合剂原液96 h接种后存活率为60%，1∶2倍比稀释浓度96 h接种后无死亡鸡胚，且数日后有健康雏鸡孵出，说明500 mg/mL的浓度对鸡胚无毒性，可作为最大安全浓度。（见表1）

表1 中药复方合剂对鸡胚的毒性作用

3.2 鸡胚EID50值Reed-Muench法计算得鸡胚EID50为10-3.83，故实验采用100EID50病毒攻击量。（见表2）

表2 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）EID50的测定

3.3中药复方合剂对甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用 与正常对照组比较，病毒对照组鸡胚均出现全身充血、出血，鸡胚死亡率100%；在安全浓度范围内，中药复方合剂高、中、低剂量组对鸡胚均有保护作用，其中3种给药方式的中药复方合剂高剂量组鸡胚存活率为100%，与病毒对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；同时给药和预防给药方式的中药复方合剂中剂量组鸡胚存活率为100%，高于治疗给药方式的中药复方合剂中剂量组（83%），中药复方合剂低剂量组对鸡胚也有一定程度的保护作用，同时给药、预防给药和治疗给药鸡胚存活率分别为83%、67%、67%，说明不同的给药方式对鸡胚的保护程度不同，同时给药效果最好。在血凝滴度试验中，如果药物组血凝滴度低于病毒对照组的1/4，说明药物对病毒增殖有抑制作用[6]，结果显示，同时给药方式的中药复方合剂高、中剂量组，以及预防给药和治疗给药方式的中药复方合剂高剂量组血凝滴度均低于病毒对照组的1/4（P<0.01），具有明显抑制流感病毒的作用，而且同时给药强于预防给药和治疗给药，预防给药略强于治疗给药。（见表3~5）

表3 同时给药方式对鸡胚的保护作用

表4 预防给药方式对鸡胚的保护作用

表5 治疗给药方式对鸡胚的保护作用

4 讨 论

传染性疾病在中医学上属“时疫”“温病”的范畴[7]，在临床实践中，主要采取清热、解毒的治疗原则[8-9]。中药复方合剂为传统中药材，以解表药、清热药和补益药为主药，通过直接杀灭病毒、抑制病毒唾液酶活性、阻断病毒吸附等途径发挥抗病毒作用[10]。现代药理学研究证明，板蓝根、黄芩、柴胡、甘草、金银花、鱼腥草等具有明显的抗流感病毒作用[11]，从这些中药中提取分离得到抗流感病毒的活性成分包含黄酮、挥发油、有机酸、多糖、生物碱等不同类别。板蓝根具有清热解毒、凉血利咽之功效，成分中的生物碱、苯丙素、有机酸等能通过抑制病毒增殖，预防和阻断病毒附着而发挥其抗流感活性，由醇提部位制取的总有机酸部位抗A/PR/8/34（H1N1）药效最强[12]；黄芩中富含四十多种黄酮类物质，主要有效成分黄芩苷、黄芩素均有抗H1N1活性，机制包括直接抗病毒作用和调节免疫炎症反应两方面[13]；柴胡中多种柴胡皂苷对于Na+，K+-ATP酶有很强的抑制作用，能引起能量和水盐代谢的变化，从而起到抗病毒作用[14]。此外，柴胡多糖有促进免疫的作用，可增加Kupffer细胞的吞噬功能和NK细胞的功能；甘草粗提物、甘草甜素均具有抗流感病毒作用，甘草多糖能增强小鼠机体免疫作用[15]；黄芪具有补气升阳、调节免疫功能的作用，化学成分包括皂苷类、多糖、黄酮类等[10]；金银花作为清热解毒的代表药，含以上多种成分，其水煎液能明显降低甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小鼠的肺指数，使小鼠肺部病变程度明显减轻[16]。金银花有抗炎、解热、增强机体免疫功能的作用。因此，中药复方合剂对H1N1的抑制作用并不是单纯的抗病毒，而是多方面、多角度、多途径发挥作用，体现出中医疗法的整体特点。

本实验采用鸡胚法3种给药方式观察中药复方合剂的抗病毒效果，方式一（同时给药）是验证药物对病毒的直接灭活作用；方式二（预防给药）是验证药物对病毒入侵的阻断作用；方式三（治疗给药）是验证药物对病毒增殖的抑制作用；结果表明，中药复方合剂3种给药方式对鸡胚均有一定的保护作用，但是程度有所不同，250 mg/mL时鸡胚存活率为100%，与病毒对照组比较，差异有统计学意义；流感病毒抑制结果显示，同时给药、预防给药和治疗给药方式的药物浓度在62.5、125.0、250.0 mg/mL时表现有抗病毒活性，对甲型H1N1流感病毒均有抑制作用，并在安全浓度范围内，呈现一定的量效关系，且同时给药方式抗病毒作用强于其他两组。由此可见，中药复方合剂对H1N1流感病毒的防治虽以非特异性为主，但因通过机体免疫保护宿主，强调辨证，因而具有广泛的适应性，为临床抗病毒用药提供了实验依据。