杨新选，任航

咸阳市第一人民医院泌尿外科，陕西 咸阳 712000

膀胱癌是泌尿系统三大常见恶性肿瘤之一。2020年全球膀胱癌新发病例573 278例，死亡病例212 536例，分别占癌症发病和死亡病例的3.0%、2.1%[1]。膀胱癌发病具有隐匿性，患者多因肉眼血尿就诊，已失去最佳治疗时间。膀胱镜虽然是诊断膀胱癌的金标准，但属有创操作，痛苦较大，因此寻找有效、可靠、便捷的生物学标志物很有必要。微小RNAs(microRNAs，miRs)是一类长度为21～25个核苷酸的非编码RNAs，研究表明，膀胱癌患者体内存在多种miRs异常表达，与肿瘤发生和发展密切相关[2]。miR-143、miR-145均位于人类5号染色体，miR-144位于人类7号染色体，在多种肿瘤中呈低表达，具有抗癌基因作用，如乳腺癌中，miR-143可通过降低细胞外信号调节激酶5抑制肿瘤细胞生长[3]；miR-144可通过抑制中心体相关蛋白55抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移[4]；miR-145可通过靶向雌激素受体-α抑制肿瘤细胞的侵略性等[5]。本研究分析膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平变化，并探讨三者与膀胱癌临床病理特征的关系及其对膀胱癌临床诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取咸阳市第一人民医院泌尿外科2016年1月至2017年1月收治的83例膀胱癌患者为膀胱癌组，其中男性49例，女性34例；年龄47～83岁，平均(62.58±8.74)岁；肿瘤直径1.2～5.6 cm，平均(3.21±0.87)cm；TNM分期：Ta期12例，T1期19例，T2期17例，T3期31例，T4期4例；分化程度：未分化6例，低分化35例，中分化19例，高分化23例；淋巴结转移者36例，淋巴结未转移者47例。纳入标准：(1)符合《欧洲肿瘤医学协会膀胱癌诊断、治疗和随访实践指南》[6]诊断标准；(2)患者及家属均知情同意；(3)临床资料完整；(4)可接受随访者；(5)意识清楚。排除标准：(1)血液系统疾病者；(2)全身免疫性疾病者；(3)重要脏器功能损害者；(4)合并其他恶性肿瘤者；(5)近1个月内接受激素和免疫制剂治疗者。另选取同时期48例在我院体检的健康者为对照组，其中男性28例，女性20例；年龄38～78岁，平均(61.58±7.83)岁。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 检测方法 收集两组受检者5 mL空腹静脉血，室温静置10 min，1 000 r/min离心1 min，分离血清，总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：R1200)提取总RNA，反转录试剂盒(杭州海基生物技术有限公司，货号：D1802)反转录为cDNA，进行RT-qPCR扩增。miR-143上游引物：5'-TGAGATGAAG CACTGT-3'，下 游 引 物：5'-ACATCGACTGTAGCATA-3'；miR-144上游引物：5'-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCGGAGGT-3'；miR-145上游引物：5'-TCCGATTGAGTCATTACCAT-3'，下 游 引 物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。反应体系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反应条件：95℃预变性30 s、95℃变性5 s、60℃退火35 s，72℃延伸30 s，循环40次。以U6做内参基因，上游引物：5'-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3'，下 游 引 物：5'-CTTGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 应 结 束后得到各反应管Ct，2-ΔΔCt法计算血清miR-143、miR-144、miR-145相对表达量。

1.3 随访 通过电话和门诊随访等方式对患者进行随访，随访截止2020年1月30日，总生存期定义为化疗开始到随访截止时间或死亡。

1.4 统计学方法 应用SPSS26.0统计学软件分析数据，计数资料比较采用χ2检验；正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验；偏态分布计量资料以[M(P25，P75)]表示，采用Z检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间生存率Log-rank检验；受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析指标对膀胱癌的诊断价值，曲线下面积(area under curve，AUC)采用Z检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比较 膀胱癌组血清miR-143、miR-144、miR-145水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组受检者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比较(±s)

表1 两组受检者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比较(±s)

组别膀胱癌组对照组t值P值例数83 48 miR-143 0.20±0.07 1.07±0.36-16.672 0.001 miR-144 0.54±0.11 0.89±0.18-12.194 0.001 miR-145 1.37±0.72 5.66±1.76-16.107 0.001

2.2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平与膀胱癌临床病理特征的关系 血清miR-143、miR-144和miR-145水平与膀胱癌患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无关，差异无统计学意义(P>0.05)，与TNM分期和淋巴结转移有关，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平与膀胱癌临床病理特征的关系[±s，M(P25，P75)]

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平与膀胱癌临床病理特征的关系[±s，M(P25，P75)]

病理特征性别例数miR-143 t值-0.254 P值0.800 miR-144t值1.553 P值0.124 miR-145 t值-1.643 P值0.106男女49 34 0.20±0.06 0.21±0.07 0.56±0.11 0.52±0.12 1.26±0.60 1.54±0.84年龄(岁)≥60<60肿瘤大小(cm)≥3<3 TNM分期Ta～T1 T2～T4分化程度低未分化中高分化淋巴结转移46 37 43 40 31 52 41 42 0.20±0.07 0.21±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06 0.22±0.07 0.19±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06-1.369-1.917 2.154-1.675-2.684 0.175 0.059 0.034 0.098 0.009 0.54±0.12 0.55±0.11 0.51(0.46,0.59)0.56(0.46,0.65)0.58±0.10 0.52±0.12 0.52±0.10 0.56±0.13-0.386-1.044 2.084-1.658-2.359 0.700 0.296 0.040 0.101 0.021 1.34±0.80 1.42±0.62 1.24±0.76 1.52±0.65 1.57±0.60 1.26±0.76 1.29±0.81 1.45±0.61-0.546-1.822 2.053-1.024-2.289 0.587 0.072 0.044 0.307 0.021是否36 47 0.19±0.06 0.22±0.06 0.51±0.12 0.57±0.10 1.17±0.79 1.53±0.62

2.3 血清miR-143、miR-144和miR-145水平与膀胱癌预后的关系 随访6～36个月，中位时间18个月，共死亡18例，3年总生存率为78.31%(65/83)，以血清miR-143、miR-144和miR-145的中位数0.19、0.53、1.38为基准，分为高、低表达组。高miR-143水平组(n=43)总生存率为88.37%(38/43)，低miR-143水平组(n=40)总生存率为67.50%(27/40)；高miR-144水平组(n=41)总生存率为87.80%(36/41)，低miR-144水平组(n=42)总生存率为69.05%(29/42)；高miR-145水平组(n=43)总生存率为90.24%(37/41)，低miR-145水平组(n=42)总生存率为65.85%(27/41)；Kaplan-Meier曲线显示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平组总生存率高于低miR-143、miR-144、miR-145水平组，差异有统计学意义(Log-Rankχ2=4.781、4.686、7.070，P=0.029、0.030、0.008)，见图1。

图1 膀胱癌患者预后的Kaplan-Meier曲线

2.4 血清miR-143、miR-144和miR-145水平对膀胱癌的诊断价值 ROC曲线显示，miR-143+miR-144+miR-145预测膀胱癌的AUC明显大于miR-143、miR-144、miR-145单 独 预 测(Z=2.777、3.173、3.188，P=0.006、0.002、0.001)，见表3，见图2。

图2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平诊断膀胱癌的ROC曲线

3 讨论

膀胱癌的发生和发展是多基因、多阶段、多因素共同作用结果，早期确诊困难，膀胱癌中80%为非浸润性肿瘤，未侵入膀胱逼尿肌，及时给予有效治疗可避免其发展为浸润性膀胱癌，改善患者预后。随着分子学研究的不断发展，各类靶向药物虽然提升了患者预后，但获得性耐药越来越多，因此发现膀胱癌新的治疗靶点具有重要意义。miRNAs是近年来新发现的一种小RNA，可在转录后可调控基因表达，调控细胞多种生物学行为，且50%以上位于肿瘤相关的脆性位点或基因区域，与肿瘤发生和发展密切相关，循环血液中miRNAs具有较高稳定性，不易被RNA酶降解，因此血清miRNAs水平可成为癌症重要生物标志物。

miR-143和miR-145由MICHAEL等[7]首次于2003年报道，该报道显示，结直肠癌组织中miR-143、miR-145表达下调，提示miR-143、miR-145可能参与结直肠发生。近年来大量研究证实，miR-143、miR-145参与多种恶性肿瘤进展，如LIU等[8]研究报道，食管鳞癌细胞中miR-143表达下调，可靶向抑制人LIM和SH3蛋白1(LASP-1)表达，抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭。NABIPOORASHRAFI等[9]研究报道，黑色素瘤细胞中miR-143表达下调，可通过下调C-X-C基序趋化因子受体4、波形蛋白、钙黏蛋白、基质金属蛋白酶9等转移相关基因抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移和促进凋亡。SU等[10]研究报道，食管癌细胞中miR-145表达下调，可靶向RAR相关孤儿受体(RAR-related orphanreceptor，RORs)抑制食管癌细增殖和迁移。WEI等[11]研究报道，宫颈癌细胞中miR-145表达下调，可靶向尿路上皮癌相关1基因抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。上述研究提示miR-143、miR-145在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用。我们研究发现，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平明显降低，可能与受其他因子转录后调控或编码基因突变等有关。同时结果还显示，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平与TNM分期和淋巴结转移有关，提示miR-143、miR-145在膀胱癌中也可能发挥抑癌基因作用。研究发现，膀胱癌组织中miR-143、miR-145表达下调，与欧洲癌症研究与治疗组织风险评分呈正相关，提示两者具有抑制肿瘤存活效应作用[12-13]。其机制可能与miR-143能靶向抑制MYB原癌基因2抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭，和miR-145能靶向调节SRY盒转录因子11抑制膀胱癌细胞增殖、周期进展、促进凋亡有关[14-15]。

miR-144的前体以miR-144/miR-451簇形式存在，序列高度保守，最早研究发现其参与了红细胞表型转变，在红细胞生成与贫血中发挥重要作用；随着研究的进展，研究发现miR-144在多种肿瘤发生和发展受中也扮演重要角色。如CHENG等[16]研究报道，结直肠癌细胞中miR-144表达下调，能靶向前B细胞白血病转录因子3抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭。MUSHTAQ等[17]研究报道，胃癌细胞中miR-144表达下调，能靶向激活增强子结合蛋白4抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。提示miR-144也在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用。笔者研究显示，膀胱癌患者血清miR-144水平明显降低，且与TNM分期和淋巴结转移有关，考虑与癌细胞突变后影响了miR-144调控机制导致其表达降低有关，并提示miR-144在膀胱癌中发挥抑癌基因作用。GUO等[18]通过miR-144抑制剂阻断内源miR-144表达，发现膀胱癌细胞增殖明显加快，而增强其表达则会抑制细胞增殖，其机制与miR-144能靶向zeste同源物2抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路激活进而抑制膀胱细胞增殖有关，进一步验证了本研究结果。我们结果显示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平的膀胱癌患者3年总生存率明显提高，说明低血清miR-143、miR-144、miR-145水平还可能直接影响膀胱癌患者预后，分析与低血清miR-143、miR-144、miR-145水平可引起膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭有关。结果还显示，miR-143、miR-144、miR-145均对膀胱癌具有较高准确度，但特异度较低，而联合检测不仅能诊断特异度，还可提升诊断敏感度、准确度，说明联合检测诊断效果更好，可帮助临床早期诊断，并帮助评估膀胱癌严重程度和预后。

综上所述，膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平明显降低，与临床病理特征有关，联合检测可提升膀胱癌诊断效能，有望成为膀胱癌的潜在治疗靶点。