肖洒 邓晓东 贺常皓 李亚军 费小雯*

（1.海南医学院 基础医学与生命科学学院，海南 海口 571199；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

RNAi（RNA interference）技术是一项基因沉默技术，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发同源mRNA高效特异性降解的现象，从而阻断特定目的基因的表达，最终影响蛋白质合成。作为一种高效的基因抑制技术，目前在农业抗害虫、作物改良、医学疾病治疗、未知基因功能探究等领域广泛应用。

1 RNA干扰的发现

Guo等在1995年从事RNAi的研究，经研究发现，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎生长发育时期，成功地将外源的Part 1基因双链RNA导入体内，可导致线虫该基因表达明显下调［1］，同样Fire等在1998年，研究发现当肌肉注射外源dsRNA于线虫体内，该目的基因的表达明显被抑制［2］。

2 RNA干扰机制

真核生物在RNAi基因沉默过程中包含3种重要的非编码小RNA,即mi RNA（microRNA）、siRNA（small interference RNA）和piRNA（Piwi-interacting RNA）。由siRNA介导的基因沉默过程包含以下部分：（1）首先将人工合成的或与体内相同的dsRNA，与靶基因相同序列的有义RNA和反义RNA结合，然后经RNaseIII家族特异性Dicer酶识别，切割成21～23nt siRNA，当R2D2蛋白和Dicer酶形成异源二聚体，紧接着与siRNA结合形成RISC装载复合物，然后AGO蛋白与Dicer交换，结合到siRNA的一端，再与R2D2替换，将整个siRNA转载到AGO蛋白中，形成有活性的沉默复合物（RNA-induced silencing complex），由于AGO蛋白含有PAZ、MID、PIWI三个重要功能结构域，siRNA引导链的5’端与MID结合，与3’端露出的两个核苷酸与其PAZ结合，通常siR⁃NA的第28个核苷酸与靶mRNA特异性配对，长约10个核苷酸的mRNA一般切割在第9、10个核苷酸上，由PIWI催化将靶mRNA切断，使其离开RISC，再通过胞外切酶进一步降解mRNA。（2）siRNA对基因沉默，包括转录水平mRNA转录尚未启动，siRNA分子通过诱导DNAGC岛中C和组蛋白H3的第9个lys甲基化、异染色体质的形成、DNA分子消融和重组，转录后水平的基因沉默主要分为启动、剪接、循环放大3个阶段［3］。

3 dsRNA导入方式

目前对于RNAi干扰技术应用，最主要突破点是选择一种合适的RNAi导入途径。现有的RNAi导入主要有三种方法。

3.1 显微注射法

首先在体外合成dsRNA，通过显微注射仪器成功注射至昆虫体内［4］，此方法直接作用于靶组织，避免了表皮、中肠等器官对dsRNA的干扰破坏。20世纪90年代至21世纪，Kennerdell［5］和Carthew［6］先后通过显微注射法，将体外合成的目标基因的dsRNA导入黑腹果蝇胚胎内，从而得到这两个基因的缺陷型果蝇。随后Brown等越来越多的科研人员使用显微注射法对鞘翅目、鳞翅目等类昆虫实现RNAi的研究［7-9］。此方法对实验仪器操作精确度要求高，且仅适用于实验室基因功能方面的基础研究。

3.2 浸泡法

首先将体外合成的目的dsRNA放在组织培养基内，随着细胞培育传代便可吸收培养基中的dsRNA，从而诱导由siRNA介导的基因沉默，经检测和显微注射法实现同样效果，但是需要更高的dsRNA浓度［10］。2000年Caplen［11］等就曾成功实现了利用浸泡法，将组织培养的dsRNA对黑腹果蝇进行目的基因的缺失表达的实验，亦有对白纹伊蚊（Aedes albopictus）和埃及伊蚊（A.aegypti）干扰目的基因功能的研究的报道［12,13］，该方法的不足之处是转染dsRNA的方式对于操作过程和条件要求较高，首先转染的细胞要处于状态较好的特定发育时期，其次培养基的浓度和外部条件适宜等［14］。

3.3 饲喂法

依据昆虫具有取食的特点，利用转基因技术将目的片段转入幼虫取食的植株或菌株作为介质,通过喂饲以后经肠粘膜细胞吸收dsRNA进入体内循环，产生siRNA干扰机制，使致死靶基因特异性沉默，致使幼虫发育成熟障碍，从而有望起到防控害虫目的［15］。此方法遵循生物发育生长进食规律，对虫体伤害性小，不需要精密的设备，操作相对简单，易于走出实验室在自然环境下实现。近年来根据有害昆虫吃食喜好，饲喂转基因植株、改良转基因农作物用于防控害虫的研究成为了探索的热点。

4 RNAi技术防控害虫的应用

根据RNA干扰机制，以害虫生长发育所需靶基因作为干扰目标，将目标基因dsRNA导入虫体，影响其转录和翻译蛋白合成过程，最终导致害虫不能正常发育直至死亡［16］。

Tian等［17］研究害虫甜菜夜蛾幼虫几丁质合成酶基因A（SeCHSA）为靶基因，以大肠杆菌表达SeCH⁃SA dsRNA，喂食在4龄、5龄幼虫、前蛹和蛹期dsRNA饲料，甜菜夜蛾平均存活率分别为88.64%、74.24%、68.43%和62.63%。玉米飞虱农艺作物的主要害虫，空泡ATPase（V-ATPase）是一种重要的酶，在水解ATP和质子的运输，维持膜离子平衡发挥重要作用，Jianxiu等［18］在本研究中以VATPase亚基的基因（V-ATPase B和V-ATPase D）作为RNAi的靶基因，实验采用口服和微量注射，与对照组昆虫相比，其死亡率更高，繁殖力更低，显微镜检查这些昆虫雌性生殖器官发育不正常。Zhou等［19］以害虫黄胸白蚁为研究对象，一个编码内源性消化纤维素酶Cell-1为靶基因，另一个编码调节六聚体储存蛋白hex-2基因为靶目标，采用dsRNA喂食的方法，内葡聚糖酶基因沉默，对白蚁摄取营养能力明显受损，降低了下游纤维素解聚酶活性，而六聚体储存蛋白的沉默是通过联合保幼激素的作用，进而抑制工蚁与兵蚁之间的表型分化。美洲锥虫病（American try⁃panosomiasis）又名Chagas病重要的传播媒介是嗜血锥蝽，无论是幼虫、成虫均喜好叮咬面部和较薄的皮肤区域，Araujo等［20］研究对唾液腺亚硝磷酸核糖核酸Nitrophorin 2（NP2）基因干扰，幼虫蜕皮后7天提取的唾液腺用于活性试验NPs表达减少、柠檬酸血浆再钙化时间缩短、磷酸酶活性降低。Mao等［21］在研究饲喂棉铃虫幼虫植物材料中表达细胞色素P450基因（CYP6AE14）特异的dsRNA，发现中肠P450单加氧酶被抑制，生长发育受到阻碍，对棉酚的耐受性明显下降。另外还有报道玉米根虫［22］甲壳动物［23］山楂叶螨［24］稻纵卷叶螟［25］等昆虫的靶基因干扰和沉默效率研究。

5 RNAi技术与生物防控方法的重要结合

苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白对多种昆虫具有杀灭活性，被广泛用于生产的生物杀虫剂，以及转基因Bt作物用于特异性生物杀虫剂［26］。最新的研究表明，Bt毒素使害虫产生了不同程度的抗性，严重影响了灭虫效能，将RNAi技术沉默昆虫体内特异性基因，有利于提高昆虫对Bt毒素的敏感性，提升Bt毒素的杀虫效果。苏云金芽孢杆菌Cry3Aa毒素对马铃薯甲虫有毒杀作用，而研究结果也证明pro⁃hibitin-1蛋白与其产生抗性有关，Camila等［27］在研究中发现，通过喂食dsRNA，沉默了幼虫体内编码prohibitin-1蛋白的基因，并在含有Cry3Aa的环境下培养5天，幼虫的死亡率达到100%。利用RNAi和Bt毒素在昆虫体内的协同作用，可将两者结合应用于转基因作物，为植物抗虫性的研究开辟新道路。

6 RNAi技术规避化学杀虫剂耐药性

目前化学杀虫剂在农业防控害虫应用过程中起到重要作用，但是近年来抗药性逐渐显现出来，刘凯亮等［28］于2017年开展深圳市南山区、宝安区、大鹏新区、福田区的白纹伊蚊对常用菊酯类杀虫剂的抗药性研究，得出白纹伊蚊抗性系数都有不同程度的提高。张雨等［29］于2017年针对上海市奉贤区家蝇对敌敌畏、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯的抗性现状调查研究，该地区家蝇自然种群对以上三种药物抗性级别均为高抗。贾尊尊等［30］对新疆地区烟粉虱开展检测，结果表明烟粉虱对有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯等许多常规杀虫剂产生了高水平抗性。另外长期大规模使用化学杀虫剂势必造成环境破坏，RNAi技术的探索和发展开辟了一项新的防控害虫措施。

7 展望

尽管科研人员在RNAi技术的研究和利用方面做出了巨大的贡献和发展，但是不可规避的是依然存在诸多局限性。例如靶外结合效应，由于siRNA分子和非目标mRNA序列相似发生沉默，产生脱靶效应，导致干扰效应丧失甚至基因突变。另外还有转基因作物在自然界当中，是否给其他非靶标物种带来危害和潜在生态风险等。虽然还有许多暂时未知利弊，但是作为一项新型防害举措，相信随着分子生物学不断发展和科研学者们探索和努力，必定会不断突破，将RNAi技术应用于生产实践。