张婷婷，高慧民，谷牧青，刘瑞霞，李天鹤，阴赪宏

(首都医科大学附属北京妇产医院 北京妇幼保健院，北京 100026)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性最常见的妇科内分泌疾病，发病率为5%～20%，以高雄激素血症、排卵功能障碍和卵巢多囊样改变为主要临床特征，并可伴有多毛症、凝血功能异常、代谢功能异常等表现[1-2]。由于代谢功能异常，大多数PCOS患者会出现胰岛素抵抗(IR)或代谢综合征的表现，如肥胖、血脂异常、高血压、高胰岛素血症和血糖失调[3-4]。近年来，已有多项研究证明，PCOS患者中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生率明显高于普通人群[5-7]，且高雄激素血症、肥胖、IR和高胰岛素血症同样可促进NAFLD的发生发展[8-10]。所以，NAFLD和PCOS分别被认为是代谢综合征累及肝脏、卵巢的表现。鉴于两者发病机制相似且具有高度的临床相关性，有专家由此提出“肝-卵巢轴”的概念[11]，提示我们PCOS患者肝脏受损可能与其PCOS疾病本身有关。但是在PCOS动物模型，特别是脱氢表雄酮(DHEA)诱导的PCOS大鼠模型中，肝功能的变化以及影响因素尚不明确。

细胞凋亡是一种在进化上高度保守的细胞死亡途径，正常情况下，在机体发育过程中发挥适当剔除细胞和维持体内稳态的重要作用[12]，当细胞凋亡过程调节障碍时，可导致体内多种疾病的发生[13]。肝细胞凋亡与各种肝脏疾病，如病毒性肝炎、肝硬化、肝癌以及NAFLD之间的关系日益受到关注。人们逐渐认识到细胞凋亡是肝脏常见疾病细胞死亡的常规模式[14]。Beclin-1和Lamin B1蛋白与细胞凋亡联系紧密。当细胞生存环境发生缺乏生长因子或饥饿等异常变化时，Beclin-1蛋白可被激活并诱导凋亡的发生[15]。Lamin B1蛋白可作为Caspase-6的特异性天然作用底物，与其共同促进细胞的凋亡[16]。

因此，本研究利用DHEA构建PCOS大鼠模型，通过分析PCOS大鼠内分泌代谢水平、血清生化水平、肝脏组织结构和表达蛋白的变化，初步了解PCOS大鼠模型中肝细胞凋亡在肝脏损伤过程中所起的作用，以期为今后PCOS相关疾病的研究提供一定参考。

材料与方法

一、实验动物

3周龄SD雌性大鼠20只，购买并饲养在谱尼测试集团股份有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2016-0002。SPF级屏障系统饲养，温度为24～26℃，湿度为50%～70%，光照黑暗时间比为12 h/12 h，常规食水饲养。所有实验动物操作流程符合美国国家卫生研究院(NIH)规定的实验动物福利和道德规定。

二、主要试剂和仪器

DHEA(D8950，北京索莱宝科技)，睾酮(MC12987)、雌二醇(MC12312)、黄体生成素(MC12403)、卵泡刺激素(MC12313)的ELISA检测试剂盒均购自北京美辰联创生物科技有限公司，谷草转氨酶(AST)试剂盒和谷丙转氨酶(ALT)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Beclin-1、Lamin B1及β-tublin兔源单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，甲醇(北京化工厂)，4%多聚甲醛(G1101，武汉赛维尔生物科技)，瑞氏染色液(S7030，北京酷来博科技)；显微镜(CKX41，Olympus，日本)，胰岛素耐量的稳态模型评估使用Accu-Chek’O血糖仪(罗氏，美国)，酶标仪(Spark 10M，Tecan，瑞士)。

三、实验方法

1.实验分组：选取3周龄SD大鼠，随机分为正常对照组、DHEA组，每组10只，参照之前文献方法[17]，分别给予颈部皮下注射油剂、6 mg/100 g DHEA，1次/d，连续注射21 d。造模第22天，将两组大鼠各分为处死取材和动情周期观察两部分，每组7只大鼠处死并取材，每组3只大鼠继续进行动情周期观察。每7 d称量一次大鼠体重。

2.取材：大鼠造模第22天，将大鼠麻醉，股动脉取血并分离血清待测。颈椎脱臼法处死大鼠后，将新鲜的卵巢和肝脏组织固定于4%多聚甲醛，24 h后用于HE染色和Masson染色。

3.大鼠动情周期观察：参照文献方法[18]，从大鼠给药第22天开始，每天上午8∶00～10∶00进行阴道涂片检查(连续8 d)：将无菌棉签在生理盐水中浸湿后，放入大鼠阴道侧璧的前1/3处顺时针方向涂抹一周，取出棉签后沿同一方向涂抹到玻片上，瑞氏法染色后，镜检。动情前期涂片特征：绝大部分是小、圆的有核上皮细胞，偶有少量角化细胞；动情期：大部分是无核、不规则的角化细胞，间有少量上皮细胞；动情后期：有核细胞、角化细胞、白细胞均有；动情间期：出现大量白细胞和少量的上皮细胞。大鼠如失去规律的动情周期，或持续处于动情间期，则提示无排卵。

4.大鼠血清生殖激素水平检测：取各组血清按照ELISA试剂盒说明书检测黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、雌二醇(E2)含量，用酶标仪(Spark 10 M，Tecan，瑞士)于波长450 nm下检测其OD值。

5.大鼠血清生化检测：取各组血清按照试剂盒说明书检测AST、ALT含量，用酶标仪于波长510 nm下检测其OD值；取各组血清按照试剂盒说明书检测ALP含量，用酶标仪于波长405 nm下检测其OD值。

6.HE染色：将取到的两组卵巢和肝脏组织固定于4%多聚甲醛24 h后，常规石蜡包埋、切片，HE染色后再普通光学显微镜下观察，记录染色结果。

7.Masson染色：将取到的两组肝脏组织固定于4%多聚甲醛24 h后，常规石蜡包埋、切片、透明、脱水、染色和封片。Masson染色后在普通光学显微镜下观察，记录肝脏组织纤维化程度。每次实验中每组选取3～4只大鼠，每次实验任意选取3～4张切片。

8.蛋白质印迹法(WB)测定肝脏组织蛋白表达变化：取正常对照组、DHEA组肝脏组织，用蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白样品浓度。等量的蛋白利用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，电转移至 PVDF 膜。用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，分别加入 Beclin-1、Lamin B1的一抗(1∶2 000稀释)中，4℃孵育过夜；次日，回收一抗后，洗膜3次，分别加入山羊抗兔的二抗(1∶5 000稀释)中，室温孵育2 h，洗膜3次，将膜置于增强化学发光(ECL)法检测试剂中，凝胶成像系统显影。以目的蛋白条带灰度值与内参照β-tublin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

四、统计学分析

结 果

一、大鼠动情周期情况及卵巢病理学变化

利用6 mg/100 g DHEA注射油针剂连续颈部皮下给药21 d后，连续8 d取阴道细胞进行涂片及镜下观察，发现动情前期时存在小、圆、有核鳞状上皮细胞；动情期时存在不规则(角质化)鳞状上皮细胞；动情后期和动情间期时存在白细胞、角质化细胞和圆上皮细胞。且阴道涂片结果显示，对照组大鼠具有规律性动情周期，而DHEA组大鼠动情周期失调，大部分时间处于动情前期和动情后期，提示无排卵(图1)。HE染色结果显示，对照组大鼠卵巢组织镜下可观察到3个正常黄体和处于不同时期的多个正常卵泡，而DHEA组大鼠镜下未观察到黄体，且观察到3个囊性卵泡(图2)。说明DHEA组大鼠卵巢组织发生多囊样改变且效果显著，PCOS大鼠模型构建成功。

图示分别为两组内某大鼠连续8 d阴道涂片检查结果：红色箭头示不规则角质化鳞状上皮细胞；蓝色箭头示有核鳞状上皮细胞图1 两组大鼠的阴道涂片结果(瑞氏染色，×10)

#示黄体；*示囊状卵泡图2 两组大鼠的卵巢结构(HE染色，×10)

二、两组大鼠血清生殖激素水平比较

收集大鼠空腹血清，利用ELISA试剂盒检测血清中生殖激素水平。结果显示，DHEA组大鼠血清中T值[(28.65±6.31)nmol/L]显著高于对照组大鼠[(0.40±0.29)nmol/L](P=0.001)，而两组大鼠的FSH、LH和E2水平均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组大鼠血清生殖激素水平比较(-±s)

三、两组大鼠体重及胰岛素抵抗能力的比较

连续给药期间，两组大鼠体重比较无显著性差异(P>0.05)(图3A、B)。利用胰岛素耐量试验(ITT)检测大鼠胰岛素抵抗情况，结果显示，DHEA组在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min的血糖值均略高于对照组，但尚无统计学意义(P>0.05)(图3C)；DHEA组ITT的曲线下面积(AUC)显著大于对照组(P=0.031)(图3D)。表明PCOS大鼠较对照组葡萄糖清除能力下降，对胰岛素的敏感性降低。

A：两组大鼠体重变化的比较；B：处死前两组大鼠体重的比较；C：两组大鼠ITT实验结果的比较；D：两组大鼠ITT的AUC比较。与对照组比较，*P<0.05图3 两组大鼠体重及葡萄糖清除能力的比较

四、两组大鼠肝脏结构及纤维化程度比较

两组大鼠肝脏的大体结构见图4A。与对照组相比，DHEA组大鼠肝脏重量、肝脏/体重比显著增加(P=0.001)(图4B、C)，提示肝脏肿大。利用HE染色观察肝脏组织结构，结果显示，对照组大鼠肝细胞核大小正常，核质淡染，肝小叶结构清晰完整，肝索放射状分布于中央静脉周围；DHEA组大鼠肝细胞间结构疏松，染色变浅可见少量脂滴形成，中央静脉周围有少量炎细胞浸润(图4D)。利用Masson染色观察肝纤维变化，结果显示，对照组大鼠肝脏中央静脉和汇管区无胶原纤维，DHEA组大鼠肝脏中央静脉周围出现少量蓝色胶原纤维(图4E)。

进一步通过检测血清ALT、AST、ALP水平来评估两组大鼠的肝功能，结果显示，DHEA组大鼠血清ALT水平显著高于对照组(P=0.042)。两组大鼠血清AST、ALP水平均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

A：两组大鼠肝脏外形比较；B：两组大鼠肝脏重量/体重比较；C：两组大鼠肝脏重量比较；D：两组大鼠HE染色比较(HE染色，×10)；E：两组大鼠Masson染色比较(Masson染色，×10)。与对照组比较，*P<0.01 图4 两组大鼠肝脏组织的重量及结构比较

表2 两组大鼠血清生化指标水平比较(-±s)

五、两组大鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白表达分析

应用WB检测两组大鼠肝脏组织中的凋亡相关蛋白Beclin-1和Lamin B1，结果显示，DHEA组大鼠Beclin-1和Lamin B1蛋白的相对表达量显著高于对照组(P=0.001；P=0.002)(图5)。

A：对照组；B：DHEA组。与对照组比较，*P<0.01图5 两组大鼠肝脏组织中Beclin-1和Lamin B1蛋白的表达

六、ALT、AST、ALP水平与T值的相关性分析

为进一步探索PCOS肝损伤的原因，利用Pearson相关性分析血清T值与转氨酶之间的相关性。结果显示，ALT与T值之间存在显著正相关(r=0.606)；AST与T值之间存在正相关，但相关程度较弱(r=0.112)；ALP与T值之间存在负相关，但相关性极弱(r=-0.108)(表3)。

表3 ALT、AST、ALP水平与T值的相关性分析

讨 论

已有多项研究证实，在PCOS患者中NAFLD的发病率较高，可达34%～70%，而NAFLD在一般人群中的发病率仅为14%～34%[7-9，19]。在长期来曲唑处理的PCOS大鼠中，雄激素增加可引发肝功能损伤[20]。我们的研究在DHEA诱导的PCOS大鼠中证实，高雄激素血症是导致DHEA诱导的PCOS大鼠模型中肝损伤的重要诱因。实验结果显示，相较于对照组，DHEA组大鼠血清T水平显著升高(P=0.001)，而两组大鼠的FSH、LH和E2水平均无统计学差异(P>0.05)。这表明，DHEA诱导的PCOS大鼠血清中T值升高为其主要的性激素变化特征。同时 DHEA组大鼠血清ALT水平显著高于对照组(P=0.042)，提示PCOS大鼠肝功能不全。肝脏HE染色和Masson染色显示PCOS大鼠肝脏结构受损，有炎症性改变和纤维化形成；且DHEA组大鼠ALT与T值具有显著相关性(r=0.606)，表明高雄激素血症可导致PCOS大鼠肝功能障碍。

研究表明，高雄激素血症PCOS患者的肝脏脂肪含量高于雄激素正常的PCOS患者[21]。但目前为止，PCOS患者中高雄激素血症是如何影响NAFLD发生发展的机制尚不完全清楚。有报道推测，高雄激素血症可直接影响肝脏中的低密度脂蛋白受体，从而使PCOS患者更易发生血脂异常和NAFLD[22]。此外，雄激素也可能直接影响脂肪因子的产生，从而参与PCOS的代谢改变[23]。同时，也有研究表明与单纯NAFLD患者相比，PCOS伴有NAFLD患者血清中的特异性凋亡标记物M30水平显著升高[24]，这提示我们PCOS 患者的肝脏损伤可能是由于高雄激素血症通过促进其凋亡途径而发生发展。基于此，我们研究了PCOS大鼠肝脏组织凋亡蛋白Beclin-1和Lamin B1的表达量。Beclin-1基因也称BECN1基因，是酵母自噬相关基因At96/Vps30的哺乳动物同源基因，位于人类染色体17q21位点。Beclin-1基因可通过其BH3结构域与凋亡抑制因子Bcl-2蛋白结合，使Bcl-2与促凋亡蛋白Bax解离，从而诱导细胞凋亡[15]。核纤层蛋白是核纤层的关键形成部分之一，而核纤层则对维持细胞核形态有关键作用[16]。Lamin B1是一类细丝状多肽，也核纤层蛋白的成分之一，在维持核仁的完整性和可塑性上起重要作用，其又作为Caspase-6的特异性天然作用底物可在酶切后改变其结构，可共同促进细胞的凋亡[25]。我们的研究结果显示，PCOS大鼠肝组织中凋亡相关蛋白Beclin-1和Lamin B1蛋白的相对表达量较对照组显著升高(P<0.01)，提示PCOS大鼠肝脏组织凋亡增加。据此，我们推测在PCOS大鼠肝脏受损过程中，肝细胞存在凋亡过程且可能是由于PCOS大鼠中高雄激素血症所致。

综上所述，本研究利用DHEA构建PCOS大鼠模型，通过分析PCOS大鼠内分泌代谢水平、血清生化水平、肝脏组织结构和表达蛋白的变化，研究结果表明PCOS大鼠模型中肝细胞凋亡在肝脏损伤过程中起到一定的作用，并推测其可能是由于高雄激素水平所致。本研究为今后PCOS相关疾病的研究和诊疗提供了一定参考。