安卓，谢聪聪，赵明，王雪莹，王树松，尚丹丹*

(1.河北医科大学研究生院，石家庄 050017；2.河北省计划生育科学技术研究院，河北省生殖医院，国家卫生健康委员会计划生育与优生重点实验室/河北省生殖医学重点实验室，石家庄 050071)

统计数据调查结果显示，自2012年以来，不孕不育发病率为3%～4%，而我国不孕不育发病率高达12.5%～15%，其中女性因素占一半，不孕不育已经成为全球日益严重的问题[1-2]。自世界首例采用IVF-ET技术的试管婴儿诞生以来，筛选优质的卵母细胞和胚胎并获得健康的子代一直是IVF的目标，但影响卵母细胞质量、胚胎发育和植入的因素有很多。随着年龄的增长，女性卵巢储备功能减退，影响了卵母细胞的质量，因此会出现卵母细胞发育潜能逐渐降低，导致35岁以上女性的生育力显著下降的现象[3]。如何提高卵母细胞质量一直是不孕领域的研究热点。

线粒体是影响卵母细胞质量的一个关键因素[4-5]。线粒体是细胞内主要的产能细胞器和活性氧(ROS)的来源，可以将葡萄糖转化成丙酮酸，转运到卵母细胞中生成三磷酸腺苷(ATP)，参与减数分裂纺锤体的生成及第二次减数分裂中期(MⅡ期)纺锤体结构的维持。在减数分裂中期，卵母细胞内线粒体的动态分布可启动纺锤体的迁移，这说明线粒体动力学对卵母细胞成熟及下一步发育至关重要[6]。当线粒体出现功能异常、能量储备不足，会导致卵母细胞减数分裂异常，非整倍体发生率增加[7]。线粒体通过调节钙离子、环磷酸腺苷(cAMP)和ROS等多种信号因子，影响卵母细胞凋亡。本文主要探究线粒体形态、功能与卵母细胞发育的关系。

一、线粒体与卵母细胞发育

1.线粒体数量、结构、空间分布与卵母细胞发育：线粒体是相互连接、具有高能动性的细胞器，对于维持细胞的正常功能、生长和发育必不可少，在机体出现生理和病理变化时会发生动态改变[8-9]。Liang等[10]和刘珊等[11]研究发现卵母细胞成熟前后线粒体分布不同，成熟卵母细胞中线粒体均匀分布，而未成熟卵母细胞内线粒体分布在核周围，出现异常的线粒体体积膨大并且呈现均匀的簇状分布。所以，线粒体的空间分布可以作为卵母细胞发育程度评估的重要指标之一。

在卵母细胞发育过程中，线粒体数量会急剧增加，与初级卵母细胞相比，成熟卵母细胞的线粒体可以从几十个增加到一百多万个[12-13]。

在卵母细胞成熟和衰老过程中，线粒体和内质网等各种膜细胞器的结构会发生动态变化，细胞器聚集与生殖细胞的形成和表观遗传调控有关[9，14]。2010年，Liu等[15]通过实验确定了线粒体的3种分布模式：外围、半外围和均匀扩散，其中生发泡期(GV期)卵母细胞线粒体大多在外围分布，在发育成熟的减数分裂时期卵母细胞内，线粒体大多均匀扩散分布，少量的线粒体介于这两种分布模式之间，呈半外围分布。随着年龄的增加，卵母细胞质量下降，线粒体的状态也随之发生改变。在卵母细胞GV期，线粒体呈幼稚型，为圆形或椭圆形，少嵴，呈管泡状嵴，分布在细胞质中；当进行减数分裂时，即在生发泡破裂期，线粒体呈成熟型，长梭形，基质加深，嵴呈板层状[16]。有研究发现，年轻女性卵母细胞的线粒体多呈圆形，有少量的平行管状或泡状嵴和均匀的基质密度，而高龄(≥35岁)女性卵母细胞的线粒体细长且基质内有大量的嵴和较多的高密度颗粒，颗粒细胞中还偶尔可见线粒体肿胀或空泡[17]。

2.线粒体DNA拷贝数及完整性与卵母细胞发育：线粒体由线粒体基因组和核基因组双重编码。线粒体DNA(mtDNA)的多拷贝特性可导致异质性，是判断线粒体功能的重要指标[18]。随着年龄增长，卵母细胞线粒体自由基活性增强，mtDNA由于缺乏组蛋白和染色质结构的保护而无法自我修复，容易发生突变。所以mtDNA的拷贝数和完整性对卵母细胞质量尤为重要。

随着卵母细胞发育成熟，线粒体复制增多。到第二次减数分裂中期，1个成熟的卵母细胞内有1万个线粒体，大约5万到150万个mtDNA拷贝数[19]。卵母细胞中mtDNA拷贝数与受精、胚胎发育潜能呈正相关。Bentov等[20]发现mtDNA拷贝数少的卵母细胞发育不良。Chan等[21]研究发现年龄超过35岁的女性卵母细胞中mtDNA 4977片段缺失发生率更高，而且mtDNA拷贝数较低，提示mtDNA拷贝数与供体的年龄呈负相关。Murakoshi等[22]研究发现，与未受精卵母细胞和未卵裂胚胎相比，退化卵母细胞中mtDNA拷贝数显著降低。Pasquariello等[14]也证明小鼠和女性卵母细胞成熟前后拷贝数有显著改变，但体内成熟的卵母细胞mtDNA拷贝数高于体外成熟，表明mtDNA的降解是影响卵母细胞成熟的关键因素。

老年妇女卵母细胞中的mtDNA常发生一些与年龄相关的突变，其线粒体基因组存在同质A3302G突变，此突变破坏了高度保守的碱基对(2T-71A)并导致mt-tRNA异常，此突变携带者的mtDNA拷贝数较低，并可能导致线粒体功能障碍，进而影响卵母细胞质量和后期受精情况[23]。缺失mtDNA 4977片段会对线粒体酶类物质合成造成干扰，出现氧化磷酸化功能异常、能量合成障碍[24]。Keefe等[25]首次在老年女性卵母细胞的mtDNA上发现了5 kb的片段缺失，认为未受精卵母细胞中缺失的mtDNA可作为卵母细胞衰老的标志物。后来 Yesodi等[26]在年轻患者中发现了卵母细胞mtDNA 5286片段突变，这种突变有可能是卵母细胞质量下降的标志。

3.线粒体膜电位与卵母细胞发育：线粒体在产生能量时会将电化学势能储存于线粒体内膜，若质子及其他离子浓度的不对称分布就会在内膜两侧形成线粒体膜电位(MMP)。正常的MMP是线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的必要条件，MMP的稳定有助于维持卵母细胞的正常机能。当MMP下降时，线粒体肿胀、ATP水解、离子稳态遭到破坏，释放促凋亡因子(如细胞色素C)，促进细胞凋亡[27]。

Van Blerkom等[28]发现，MMP的高低决定了线粒体功能，包括ATP的产生、钙稳态的调节，并且发现随着女性年龄的增加，MⅡ卵母细胞中MMP会降低，进而影响胚胎发育。Martínez-Quezada等[29]研究发现在卵母细胞生小泡破裂(GVBD)阶段，暴露于全氟己烷磺酸盐(PFHXS)的卵母细胞MMP显著降低，说明PFHXS通过降低MMP抑制卵母细胞的成熟。

Liu等[30]的研究结果提示褪黑素可在体外成熟(IVM)期间通过维持人未成熟卵母细胞的MMP、降低Ca2+水平，来减轻人卵母细胞的氧化应激。加了褪黑素的卵母细胞MMP显著增加，保证了未成熟卵母细胞健康发育[31]。

4.线粒体ATP水平与卵母细胞发育：卵母细胞在发育成熟的过程中需要大量的ATP，主要通过线粒体进行氧化磷酸化(OXPHOS)反应获得[32]。OXPHOS由电子传输链(ETC)组成，ETC包括4种多聚酶复合体(复合体Ⅰ指辅酶Q氧化还原酶复合体，复合体Ⅱ指琥珀酸脱氢酶，复合体Ⅲ指细胞色素C氧化还原酶复合体，复合体IV指细胞色素C氧化酶复合体)、两种移动电子载体(NAD+/NADP+，FAD/FAM)以及ATP合酶(也称为复合物V，cV)。ETC进行细胞呼吸时会发生氧化还原反应，同时产生cV，是合成ATP的质子原动力[33]。已有研究表明，在卵母细胞和胚胎发育过程中，ATP不足会导致非整倍体增加，导致染色体分离异常[34]。此外，Zhao等[35]发现卵母细胞和胚胎中ATP含量越高，不孕症患者的妊娠结局越好。

卵母细胞成熟过程中，许多能量底物在线粒体内通过三羧酸循环和氧化磷酸化代谢途径产生ATP，充足的ATP供给保证了卵母细胞至囊胚期胚胎的发育[36]。Liu等[17]研究发现与高龄组(≥35岁)相比，年轻组(<35岁)卵泡液中颗粒细胞的ATP水平更高，并且ATP5A1作为OXPHOS的4种蛋白质之一，其表达随年龄增长而降低，说明衰老引起的颗粒细胞功能障碍主要与线粒体OXPHOS复合物表达有关，改善颗粒细胞中的OXPHOS功能可成为解决高龄女性不育症的突破口。

5.线粒体ROS水平与卵母细胞发育：线粒体既是ROS的生产者，也是ROS的靶标。mtDNA由于没有组蛋白保护，更容易因产生过量ROS导致自身受损。线粒体是ROS的一个主要来源，ROS会导致mtDNA突变的积累，反过来引起ETC功能失调，从而产生更高效的ROS，形成一个恶性循环，这是线粒体功能障碍、细胞衰老和凋亡的主要原因[37]。线粒体产生ATP的过程中，也会生成一定量的ROS，但少量的ROS会被线粒体中的抗氧化酶清除，以维持氧化还原稳态。当线粒体功能出现障碍时，ROS的产生会增加。过量的ROS可导致氧化应激，对卵母细胞发育成熟过程产生影响，加速卵母细胞的凋亡[38]。电子传递系统会持续产生ROS，使得细胞内ROS含量增加，影响线粒体功能，从而降低ATP的合成量，影响减数分裂过程中染色体分离和纺锤体装配。过量的ROS会导致卵母细胞脆弱性增加，导致纺锤体不稳定、染色体异常、端粒缩短以及衰老的卵母细胞发育能力下降。也有研究表明，高浓度的ROS会上调mtDNA突变率，造成线粒体功能障碍，降低辅助生殖技术成功率[39]。

二、线粒体功能的改善

线粒体对卵母细胞的发育和功能至关重要。通过线粒体移植、线粒体营养剂等方法增强线粒体功能，可以作为辅助治疗技术的补充治疗，以提高卵母细胞的质量，改善胚胎发育[40]。

线粒体移植是将体外分离得到的供体细胞(目前主要是颗粒细胞、卵母细胞和骨髓间充质干细胞)的线粒体，通过显微注射注入MⅡ期卵母细胞。异体体细胞线粒体移植是指用外源性体细胞正常的线粒体注射替换不孕女性的卵母细胞线粒体的一种治疗方法，即线粒体替代疗法[41]。随着技术发展，卵胞质移植、原核移植、生发泡移植、纺锤体移植、极体移植相继出现。但外源性线粒体的植入或许会导致后代出现携带两种来源线粒体的情况，因为线粒体具有异质性，所以可能会引起健康隐患[42]。

自体细胞线粒体移植是指用自身其他组织内正常细胞线粒体替换卵母细胞线粒体的一种治疗方案[43]。目前自体线粒体移植技术已在临床上应用。Tzeng等[44]首次通过线粒体移植技术将患者自己卵丘颗粒细胞的线粒体转移到了卵母细胞中，避免了供体和受体mtDNA的异质性，帮助患者成功妊娠。孔令红等[45]也发现经自体线粒体移植后，患者胚胎质量改善、妊娠率和种植率均升高。方丛等[46]利用卵母细胞内注射自体骨髓间充质干细胞线粒体技术，为解决原发不孕夫妇胚胎质量差及妊娠结局差等问题提供了新思路。自体线粒体移植会增加卵母细胞的能量并改善后续IVF结果，是治疗线粒体异常导致的卵巢储备功能减退引起不孕或多次胚胎移植失败患者的有效方法[47]。

综上所述，线粒体的数量、形态结构、mtDNA拷贝数、线粒体膜电位、产生的ATP和ROS均会影响卵母细胞的发育。随着研究的不断深入，线粒体逐渐成为评判卵母细胞质量的重要非侵入性评估手段。但是，线粒体影响卵母细胞发育的功能机制尚不明确。在原有基础上向前推进线粒体和卵母细胞发育的关系，可以改善女性卵母细胞质量，对改善辅助生殖技术临床结局和提高临床妊娠率也具有重要意义。