王 飞，钟圣伟，李 勇，胡小芬，周作红，杨姗姗

（江西农业大学 动物科学技术学院 江西 南昌 330045）

【研究意义】羊驼具有观赏和毛用双重价值。目前，一般采用化学染料对动物毛发进行染色，以获得颜色多样的动物绒毛制品，但是化学染色对环境和健康的负面影响很大。对毛色发生机制的研究，为获得人为控制的天然动物毛色提供重要理论意义。【前人研究进展】miRNAs，一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶基因mRNA 的3′-UTR 不完全互补配对，从而调控基因在转录后水平的表达[1]。近年来，越来越多的研究表明miRNAs调控许多重要的生物进程，如肿瘤的发生、炎症和发育等[2]。miRNAs对动物毛色的表型或黑色素生成具有一定的影响，如miR-137通过靶向MITF导致小鼠毛色从黑色变为棕灰色[3]。【本研究切入点】基于实验室前期的研究[4]，发现miR-7081-5p在白色和棕色羊驼皮肤中呈差异表达，推测miR-7081-5p 可能参与毛色的形成。通过miRBase、TargetScan 等生物信息学软件预测miR-7081-5p的靶基因，均发现sex-determining region Y-box 6（SOX6）为miR-7081-5p的靶基因之一。最近的研究表明SOX6在色素生成中具有一定的作用[5]。因此推测miR-7081-5p可能通过抑制靶基因SOX6的表达进而影响黑色素细胞内色素的生成。【拟解决的关键问题】本研究通过在羊驼黑色素细胞中过表达miR-7081-5p检测SOX6及相关色素生成基因的表达变化，酪氨酸酶活性的变化，以及总黑色素，真黑素和褐黑素的含量变化，从而为揭示miR-7081-5p靶向SOX6在色素生成过程中的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

黑色素细胞专用培养基（Sciencell，美国），基因定点突变试剂盒（碧云天，上海），双荧光报告检测试剂盒（Promega，美国），DNA 凝胶回收试剂盒（碧云天，上海），兔抗多克隆一抗：SOX6、MITF、TYR、TYRP1和TYRP2（Abcam，美国），兔抗β-actin 多克隆一抗（康为世纪，北京），山羊抗兔二抗（康为世纪，北京），Trizol（Invitrogen，美国），转染试剂Lipofectamine 2 000（Invitrogen，美国），qRT-PCR 试剂盒（Takara，大连），RIPA 裂解液（碧云天，上海），pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-7081-5p 真核表达载体由Invitrogen 公司合成，引物由北京六合华大科技股份有限公司合成。

1.2 pmirGL0-SOX6 3'-UTR双荧光报告载体和突变载体的构建

羊驼来自山西农业大学羊驼养殖基地，背部剪毛，消毒后，用取皮器采取皮肤组织，并置液氮中保存。研磨后，用Trizol法提取RNA，并转录为cDNA。根据miRBase生物学软件中SOX63′-UTR 的序列利用primer 5.0软件设计引物，并加相应的酶切位点，以羊驼皮肤cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系：Mix 5 μL，Forward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 补足至10 μL。反应结束对所扩PCR 产物进行胶回收，回收产物进行测序验证。测序正确后，回收产物和pmirGL0分别进行双酶切反应，将其酶切产物进行T4连接，转化，提取质粒，测序，从而获得pmirGL0-SOX6 3′-UTR 双荧光报告载体，命名为SOX6-wt。以pmirGL0-SOX6 3′-UTR 双荧光报告载体为模板，按照基因定点突变试剂盒进行靶位点的碱基突变试验，将突变后的产物转化，提取质粒，测序，从而获得pmirGL0-SOX6 3′-UTR突变载体，命名为SOX6-mut。质粒于-80 ℃保存，备用。所用引物序列见表1。

表1 miR-7081-5p和mRNAs引物序列Tab.1 miR-7081-5p and mRNAs primer sequences

1.3 靶基因验证试验

培养HEK 293T 细胞，待其融合度达到60%～75%时，进行转染。转染设为2 组：（1）SOX6-wt+miR-7081-5p/NC，（2）SOX6-mut+miR-7081-5p/NC，进行共转染，每组设3 个重复。待转染结束后，收集细胞，按照双荧光报告检测试剂盒操作说明进行实验。分别读取海肾和萤火虫荧光素酶反应强度值。萤火虫萤光素酶值/海肾萤光素酶值进行数据分析。所用引物序列见表1。

1.4 qRT-PCR检测

培养羊驼黑色素细胞至融合度60%～75%时，进行miR-7081-5p/NC 转染（每组设3 个重复）。转染56 h 后，用Trizol 法提取细胞总RNA，用NanoDrop 测其OD260/OD280值及浓度，取1 μL 进行RNA 快速凝胶电泳，并按照反转录试剂盒说明书进行反转录。按照qRT-PCR 说明书进行操作，每组设3个重复。目的基因相对表达量采用2-△△Ct[6]进行计算，荧光实时定量PCR 结果均用均值±标准差（Means±SD）表示，其中各基因的表达量所示结果均由内参基因β-actin的表达量进行校正，所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析检验。

1.5 Western blotting蛋白免疫印迹试验

培养羊驼黑色素细胞至融合度60%～75%时，进行miR-7081-5p/NC 转染（每组设3 个重复）。转染56 h 后，用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，测其浓度后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜至NC 膜。NC 膜用5%封闭液进行封闭，1 h。加入稀释后的一抗，4 ℃，过夜孵育。次日室温回温30 min，洗膜，5 min×6 次，用含有HRP 标记的二抗，37 ℃，孵育1 h。洗膜后用ECL 发光试剂盒显色后曝光。对获得的目的条带进行扫描分析。利用Image-ProPlus 6.0软件测定目的蛋白的灰度值，并进行半定量分析。数据用Means±SD表示，全部数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析检验。

1.6 细胞免疫组织化学

将培养好的黑色素细胞消化后接种于含有爬片的24 孔细胞培养板中，转染56 h 后，取出。PBS 冲洗，4%多聚甲醛固定20 min，3%过氧化氢室温孵育15 min，PBS 冲洗，细胞爬片用牛血清白蛋白封闭，37 ℃，25 min。在爬片上滴加稀释后的SOX6 一抗，4 ℃，过夜孵育。次日，洗膜后，用含有HRP 标记的二抗，37 ℃，孵育30 min。DAB显色后，在显微镜下观察结果。设阴性对照组，用IgG代替一抗。

1.7 黑色素含量的测定

培养羊驼黑色素细胞至融合度60%～75%时，进行miR-7081-5p/NC转染。转染56 h后，PBS吹洗并消化计数。总黑素的测定：在细胞团块中加入300 μL 的0.2 mol/L 的NaOH 溶液，充分溶解后，80 ℃，5 min。酶标仪475 nm下测其OD值。真黑素的测定：在细胞团块中加入300 μL 30%的氢碘酸，80 ℃，2 h；冷却后，加入300 μL 50%乙醇，2 234 g离心10 min，取沉淀；在沉淀中加入0.2 mol/L的NaOH，80 ℃，4 h，取溶解后的样品，10 700 g 离心10 min，取上清，酶标仪350 nm 下测其OD 值。褐黑素的测定：在细胞团块中加入300 μL 0.1 mol/L PBS（pH=10.5），室温剧烈混合10 min，10 000 r/min，离心10 min，取上清。在上清液中加入300 μL氯仿，振荡混匀，4 000 r/min，离心10 min，取黄色上清液。上清液，10 000 g，离心10 min。取上清，酶标仪400 nm下测其OD值。每组均设3个重复。

1.8 酪氨酸酶活性的测定

培养羊驼黑色素细胞至融合度60%～75%时，进行miR-7081-5p/NC转染。转染56 h后，消化离心，PBS清洗3次；PBS重悬细胞，加入96孔板，100 μL/孔，每组设3个重复；每孔加入1%Triton X-100，100 μL，混匀，20 ℃，孵育1 h；加入PBS稀释的0.1%的左旋多巴，100 μL，37 ℃，孵育2 h，酶标仪460 nm测其OD值。

2 结果与分析

2.1 羊驼皮肤总RNA的鉴定

Trizol 法提取羊驼皮肤总RNA，用核酸浓度测定仪测定其浓度和质量，并进行凝胶电泳实验检测RNA。核酸测定仪测定OD260/OD280比值为1.80～2.00，其纯度较好；凝胶电泳结果显示，RNA 样品的28S，18S和5S条带清晰可见，符合进行后续实验的要求（图1）。

图1 皮肤总RNA 1%凝胶电泳结果Fig.1 Total RNA of skin by 1%agrose gel

2.2 SOX6为miR-7081-5p的靶基因

miRBase、TargetScan 等生物信息学软件预测miR-7081-5p 的靶基因，均发现SOX6是miR-7081-5p 的靶基因，且具有7 个nt 种子序列（图2A）。SOX6-wt/ pmirGL0-SOX6-mut 和miR-7081-5p/NC，共转染HEK 293T 细胞后，检测荧光信号的变化情况。结果显示：与SOX6-wt+NC 组相比，pmirGL0-SOX6 -wt+miR-7081-5p 组荧光素酶活性显著下调42.54%（图2B）；与SOX6-mut+NC组相比，SOX6-mut+miR-7081-5p组荧光素酶活性无显著变化（图2C），通过荧光素酶活性的检测证实SOX6 是miR-7081-5p 的靶基因。

图2 SOX6与miR-7081-5p靶向关系验证Fig.2 SOX6 is one of target genes of miR-7081-5p

2.3 miR-7081-5p过表达对SOX6 mRNA和蛋白表达水平的影响

运用qRT-PCR 实验检测转染miR-7081-5p 和NC 后的表达量变化。结果显示：miR-7081-5p 组内miR-7081-5p 的表达量显著显著高于NC 组，为NC 组的5.11 倍（图3A），可用于后续实验。qRT-PCR 检测转染miR-7081-5p 后SOX6 基因的表达差异。结果显示：与NC 组相比，miR-7081-5p 组内SOX6 mRNA 表达水平降低40.51%，差异显著（图3B）。Western blotting 和细胞免疫组织化学实验结果显示：与NC 组相比，miR-7081-5p组内SOX6蛋白表达水平降低71.69%，差异显著（见图3C～E）。这些结果表明：SOX6基因的表达受miR-7081-5p的调控。

图3 miR-7081-5p过表达对SOX6 mRNA和蛋白表达水平的影响Fig.3 The effect on mRNA and protein expression levels of SOX6 in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.4 miR-7081-5p过表达对黑色素生成相关基因和蛋白表达水平的影响

运用qRT-PCR 和Western blotting 实验检测miR-7081-5p 过表达对黑色素生成相关基因的影响。qRT-PCR结果显示：与NC组相比，miR-7081-5p组MITF、TYR、TYRP1和TYRP2mRNA表达水平分别降低63.63%、59.22%、58.84%和63.80%（图4A）；Western blotting结果显示：与NC组相比，miR-7081-5p组MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白表达水平分别降低65.23%、63.23%、58.52%和62.95%，差异显著（图4B～C）。

图4 miR-7081-5p过表达对黑色素生成相关基因mRNA和蛋白表达水平的影响Fig.4 The effect on mRNA and protein expression levels of melanogenesis-related genes in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.5 miR-7081-5p过表达对黑色素含量的影响

miR-7081-5p 转染羊驼黑色素细胞56 h 后，分别收集miR-7081-5p 组和NC 组的黑色素细胞并计数。提取各组内总黑色素、真黑素和褐黑素后，根据各组细胞数量及OD值计算总黑色素、真黑素和褐黑素的相对含量。结果显示：与NC 组相比，miR-7081-5p组总黑色素、真黑素和褐黑素的相对含量分别下降了49.03%、62.4%和63.8%，差异显著（图5）。

图5 miR-7081-5p过表达对黑色素含量的影响Fig.5 The effect on melanin amount of melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.6 miR-7081-5p过表达对酪氨酸酶活性的影响

miR-7081-5p转染羊驼黑色素细胞56 h后，分别收集miR-7081-5p组和NC组的黑色素细胞，进行酪氨酸酶活性的测定。结果显示：与NC组相比，miR-7081-5p组酪氨酸酶活性显著降低了63.06%（图6）。

图6 过表达miR-7081-5p对酪氨酸酶活性的影响Fig.6 The effect on tyrosinase activity in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

3 结论与讨论

本试验通过脂质体转染法在羊驼黑色素细胞中过表达miR-7081-5p 后，引起黑色素细胞内环境的变化，导致靶基因SOX6和与色素生成关键基因表达水平降低，并降低了酪氨酸酶活性，最终导致黑色素含量的降低。

黑色素颗粒由皮肤内的色素细胞合成，决定动物毛发和人类皮肤的颜色，并能保护皮肤免受紫外线辐射所造成的伤害。动物黑色素主要分为真黑色素和褐黑色素两种，并且两者的相对数量及分布决定动物皮肤及被毛的颜色[7]。越来越多的研究表明：microRNAs（miRNAs）在人类和其他脊椎动物毛发和肤色中具有重要的作用[8]。前期通过对不同毛色羊驼皮肤miRNAs 的深度测序结果，挖掘了多个miRNAs，如miR-5110[9]、lpa-miRnov-66[10]、miR-508-3p[11]。基于实验室前期的研究，笔者发现miR-7081-5p 在白色和棕色羊驼皮肤中呈差异表达，推测miR-7081-5p可能参与毛色的形成[4]。

利用生物信息学工具，预测SOX6 是miR-7081-5p 的靶基因之一。SOX 家族包含20 个基因[12]，分为8 组，命名为SOXA 到SOXH。在大多数脊椎动物中，SOX6、SOX5 和SOX13 一起属于SOXD 组[13]。SOX10通过激活靶基因MITF，TYR，TYRP1和TYRP2调控黑色素细胞内色素的生成[14]。SOX5 与SOX10 反应元件相结合可以调控人黑色素瘤细胞内MITF 的表达[15]。作为转录调控因子，SOX 蛋白的表达受许多信号通路的调控[16-17]。它们的转录活性受翻译后修饰和隔离机制的影响[18]。在脂肪形成中，SOX6 通过抑制Wnt信号通路促进β-catenin的降解[19]，而Wnt/β-catenin信号通路参与黑色素生成[9]，因此推测SOX6可能在黑色素生成中具有重要的作用。

SOX6 是一个核内转录因子，SOX6 和SOXD 家族成员（例如SOX5 和SOX13）通过各种机制充当正转录或负转录调节因子[20]。SOX5 和SOX6 与黑色素细胞中的SOXE 基因可以共表达[21]。之前研究表明SOX6 通过调节CyclinD1基因在黑色素生成中起到激活剂的作用[5]。最新研究表明，SOX6 可以直接调控MITF 的表达[22]。MITF 在黑色素细胞的发育中具有重要的作用[23]，可以调控黑色素细胞的分化和黑色素生成酶的转录，包括TYR、TYRP1 和TYRP2[24]。本试验中miR-7081-5p 通过靶向SOX6，引起黑色素生成关键基因MITF 的表达降低，进而下调了TYR、TYRP1 和TYRP2 的表达，最终导致黑色素含量的降低。一个miRNA 会有多个靶基因，miR-7081-5p 是否还会通过其他与黑色素生成有关的基因调控黑色素含量有待进一步研究。本试验的研究结果也为进一步研究miR-7081-5p 在黑色素生成中的作用提供了理论基础。