杨 阳，黄兴法,2，王东方，刘玉兰，胡 进*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430074）

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起新生动物如仔猪、犊牛、羔羊等腹泻的主要病原菌之一[1]，其致病性主要与其具有宿主特异性的菌毛粘附素（Fimbrias）和黏附后分泌的肠毒素（Enterotoxinsl）相关[2]，含有K88 菌毛的大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原，有研究发现ETEC K88 感染仔猪后能够激活仔猪肠道上皮细胞TLR2/4-MyD88 信号通路，导致仔猪肠系淋巴结出血与肠道炎症[3]。在小鼠模型上研究结果表明，ETEC K88 感染小鼠后能够激活小鼠TLR2/4 信号通路，促进小鼠肠道炎症基因表达，引起小鼠肠道损伤与腹泻[4]。随着研究的不断深入，人们发现ETEC K88 不仅可通过促进淋巴细胞[5]、中性粒细胞、巨噬细胞在小鼠肠道与各组织器官上的聚集，还可通过诱导细胞变性，引起组织出血或水肿[6]，引起小鼠肠道组织损伤以及全身特异性免疫反应[7-10]。ETEC K88 还可激活小鼠肠道NF-κB 信号通路或Caspase3 相关的凋亡信号通路诱导肠道炎症和细胞凋亡进而导致肠道损伤[11]。然而目前并没有ETEC K88 与焦亡信号通路相关性的报道。焦亡是一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11（Caspase-11）介导的细胞死亡方式[12]，当机体受到外界刺激后，核苷酸会结合NLRs 与未活化的ASC 形成炎性复合体，进一步激活Caspase-1 促使其剪切焦亡效应分子（GSDMD）导致炎性因子IL-1β和IL-18 的释放，引起细胞焦亡[13]。活化的Caspase-11 同样能剪切GSDMD 形成GSDMD-N 端结构域寡聚化诱导焦亡。本试验采用腹腔注射ETEC K88 菌液感染小鼠，研究ETEC K88 对小鼠造成的空肠损伤以及感染后第36 h 小鼠空肠内炎症、焦亡相关基因的表达情况，探讨ETEC K88 导致小鼠肠道损伤的机制，为防控和治疗ETEC K88 引起的肠道损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 ETEC K88（血清型为O149:K91:K88ac）购于中国兽医药品监察所；BALB/c 小鼠购于北京维通利华公司；电子天平（沈阳龙腾ESK-1 系列）购于龙腾公司；Total RNA 提取试剂、cDNA 合成试剂盒、Real-time PCR 试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司；7500 Real-time PCR 仪购于Applied Biosystems 公司；梯度升降温功能PCR 仪购于TaKaRa 公司。

1.2 菌株培养 取10 μL ETEC K88 菌株甘油保存液接种在TSA 固体培养基上复苏，37℃条件下静置培养12 h，挑取复苏单菌落接种在TSB 液体培养基上复壮，37℃条件下静置培养10 h 后采用浓度梯度稀释法将菌液10倍稀释进行活菌计数。

1.3 饲养管理 将小鼠饲养在标准无特异性病原体（SPF）的鼠房中，温度控制在（22±3）℃，昼夜周期为12 h，允许小鼠自由采食。饲喂3 d 后进行正式试验。

1.4 试验设计 选取25 只体重（17±1）g 的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1×107CFU/mL ETEC K88 溶液0.2 mL。注射完成后持续观察小鼠48 h，每隔12 h对小鼠的体重与活动指数进行一次统计。在该试验得出的最适感染时间基础上，重新选取10 只体重（17±1）g的雌性BALB/c 小鼠，感染后36 h 屠宰小鼠，采集小鼠空肠进行组织形态学分析和RNA 检测。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 小鼠体重与疾病活动指数评分 ETEC K88 感染小鼠后进行持续观察，每隔12 h 对小鼠的体重进行统计。参照齐宇等[5]所述方法对小鼠体重下降率、粪便黏稠度、便血情况进行评分，取3 项观察评分的平均值作为小鼠疾病活动指数进行统计（表1）。

表1 小鼠DAI 评分标准

1.5.2 小鼠空肠组织病理学观察 感染后0 h 和36 h 屠宰小鼠，收集小鼠空肠中段，放入4%多聚甲醛进行固定，用苏木素-伊红（HE）染色后对小鼠肠道进行形态学分析，采用正置光学显微镜在目镜和物镜分别为10 倍和40 倍下拍照保存图片，采用HPIAS 高清晰度彩色病例图文报告分析系统进行肠道损伤分析。

1.5.3 mRNA 表达量测定 检测指标为炎症、焦亡相关基因，测定步骤参照陈逢[14]。以NCBI 数据库中下载的小鼠基因组序列为模板，采用引物设计软件Premier 6.0 设计引物，委托武汉擎科生物技术公司进行合成，引物序列详见表2。Real-time PCR 操作方法参考陈少魁[15]。Real-time PCR 数据分析以肌动蛋白（β-actin）为内参基因，参考livak 的2-ΔΔCt计算方法进行计算[16]。

表2 基因的引物序列

1.6 统计分析 本试验数据采用SPSS 22.0 进行独立样本T 检验和单因素ANOVA 检验。统计结果采用平均值± 标准误来表示，以P<0.05 表示显著性差异。图表采用Graphpad Prism 8.0.2 绘图软件进行制作。

2 结果

2.1 ETEC K88 感染后小鼠临床症状 感染ETEC K88后各时间点小鼠均表现出精神不振、行动迟缓、进食饮水频率降低等症状，其中以36 h 最为明显。小鼠体重随感染时间延长而下降，在36 h 降至最低值，随后出现逐渐恢复（图1）。随着小鼠体重下降，小鼠粪便出现变形、水分增多等临床变化，但在0～48 h 的连续观察中并未发现粪便隐血状况。DAI 指数在36 h 达到最高点2.0，随后呈现下降趋势（图2）。

图1 小鼠体重变化

图2 小鼠DAI 指数

2.2 ETEC K88 感染后小鼠空肠病理学观察 ETEC K88感染引起小鼠空肠损伤，与对照组（0 h）相比，ETEC K88 感染后36 h 引起了小鼠空肠充血、毛细血管出血与炎性细胞浸润。感染组空肠内中性粒细胞、淋巴细胞与浆细胞数量显著高于对照组（图3）。

图3 小鼠空肠切片（HE，40×10）

2.3 ETEC K88 刺激对小鼠肠道炎症基因mRNA 表达量的影响 由表3 可知，与对照组相比，ETEC K88 刺激36 h 后引起了小鼠空肠炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA 表达量升高（P<0.05）。

表3 ETEC K88 对小鼠空肠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表达量的影响

2.4 ETEC K88 刺激对小鼠肠道焦亡关键基因的影响由表4 可知，与对照组相比，刺激组（36 h）小鼠空肠GSDMD的mRNA 表达量上升（P<0.01），IL-18的表达量有上升的趋势（P<0.10），而Caspase-1、ASC、NLRP3的mRNA 表达量差异不显著。

表4 ETEC K88 对小鼠空肠焦亡信号通路关键基因mRNA 表达量的影响

3 讨 论

ETEC K88 是一种常见的致病性大肠杆菌，已有众多文献报道了其菌毛粘附素、耐热肠毒素和不耐热肠毒素的分子结构与合成机制[17-18]，但在其致病性的研究上目前尚未完全透彻。目前大部分研究从体外角度报道了ETEC K88感染对肠道上皮细胞造成的损伤及其机制[19]，但对ETEC K88 侵入机体引起的动物体炎症并激活相关信号通路的研究较少。张赛群等[1]研究发现腹腔注射ETEC K88 能够诱导小鼠发生显著的病理反应与组织损伤，不仅在腹腔脏器以及肠上部发现ETEC K88 黏附，在胸腔脏器以及脑、肌肉、血液中都能检测到ETEC K88 聚集，这表明ETEC K88 的致病性不仅与其产肠毒素相关，ETEC K88 的黏附性与侵袭性也应作为致病因素之一进行讨论。本试验中腹腔注射ETEC K88 引起小鼠空肠内炎性细胞浸润、毛细血管出血与空肠充血，诱发肠道炎症，这些现象证实了ETEC K88 在肠外也能发挥其致病性。

Jiang 等[20]研究发现腹腔注射ETEC K88 能诱导6～8 周龄雄性ICR 小鼠的肠道炎症，ETEC K88 刺激提高了小鼠回肠中部IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN-γ）等促炎细胞因子的表达，并且抑制了抗炎细胞因子IL-10的mRNA 表达。本试验中，ETEC K88感染引起小鼠空肠中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子表达。两个试验虽然检测的肠段不同但结果具有相似性，表明ETEC K88 感染对小肠段造成的损伤较严重。本试验发现ETEC K88 刺激上调了小鼠空肠中焦亡相关基因GSDMD和IL-18的表达量并导致肠道损伤，目前研究已发现微生物感染能激活动物体肠道焦亡信号通路，被激活的焦亡信号通路又参与到促炎因子释放与溶酶体损伤过程中，最终导致肠道屏障损伤[21]。这表明ETEC K88 刺激与焦亡存在必然的联系。而且在细胞水平上，革兰氏阴性菌组分LPS 能够激活Caspase11相关的焦亡信号通路，引起肠细胞死亡[22]。综上所述，ETEC K88 激活了小鼠空肠焦亡信号通路，促进了炎性因子的释放并破坏肠道屏障完整性从而引起了空肠损伤。

4 结 论

本试验结果表明，ETEC K88 感染小鼠后，空肠炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平升高，同时焦亡信号通路中GSDMD的mRNA 表达量显著上升，IL-18的mRNA 表达量有上升趋势。病理切片结果显示感染组空肠充血、毛细血管出血与炎性细胞浸润，空肠内聚集有大量中性粒细胞、淋巴细胞与浆细胞。表明ETEC K88 感染可上调焦亡信号通路相关基因的表达量引起小鼠的肠道损伤，诱发肠道炎症。