张冰冰，鲁科达，张培培，叶黎青，马红珍

(1浙江中医药大学·浙江 杭州 310053；2浙江中医药大学附属第一医院·浙江 杭州 310006；3浙江中医药大学附属第三医院·浙江 杭州 310009)

心血管事件是导致慢性肾脏病患者死亡的主要原因，其中动脉粥样硬化是心血管事件发生的重要原因之一。慢性肾脏病患者的动脉粥样硬化较正常人发病率高、表现更严重，可能与慢性肾衰竭患者氧化应激、营养不良、微炎症等多重非传统因素有关[1]，初步研究证实这些因素往往也可激活泛素-蛋白酶体通路，也有研究证实慢性肾衰竭大鼠主动脉泛素-蛋白酶体信号通路显著活化[2]。消瘀泄浊饮是笔者临床上用于治疗慢性肾衰竭的基本方，临床和动物实验证实具有改善肾功能的作用[3-5]。前期动物实验也表明该方具有抗慢性肾衰竭动脉粥样硬化作用[6]。本研究拟观察消瘀泄浊饮对慢性肾衰竭大鼠主动脉基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、主动脉泛素-蛋白酶体通路相关组分Ubc、Ube2b、PsmA1表达的影响，探讨消瘀泄浊饮抗慢性肾衰竭动脉粥样硬化的机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(160±20)g，购于中科院上海实验动物中心，实验动物生产许可证号码：SCXK(沪)2017-0005。饲养于浙江中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号码：SYXK(浙)2018-0012。所有大鼠均在全封闭SPF状态下隔离饲养。

1.2 主要药品和试剂 消瘀泄浊饮由生黄芪30 g、制大黄10 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龙12 g、车前草20 g组成，所含中药均由浙江中医药大学附属第一医院中药房提供，浓缩成浓度为0.96 g·mL-1的药液，4 ℃保存备用；阿托伐他汀钙(立普妥)：由辉瑞制药有限公司生产，生产批号：J6348，规格：20 mg/片。高脂饲料(2%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、87.8%基础饲料)：由浙江中医药大学动物实验中心加工配制。MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1免疫组化检测试剂盒：博奥森公司提供公司，批号：131200w、131210w、140323 w、131230w。

1.3 主要仪器和设备 AU640全自动生化分析仪：Olympus，Japan；LEICA彩色病理图像分析系统,LEICA公司，Germany；生物安全柜：海尔集团；荧光定量PCR仪：Bio-Rad iQ5，American；微量核酸测定仪：上海在途生物科技有限公司。

2 方法

2.1 动物造模及分组给药 40只大鼠普通饲料适应性饲养1周后，随机选取10只作为正常对照组，参照本课题组改良的慢性肾衰竭营养不良动物模型[7]采用二步法5/6肾切除制作CRF模型，第二次术后予高脂饮食喂养，制作CRF动脉粥样硬化模型。造模10周后成模大鼠随机分为模型组、立普妥组、消瘀泄浊饮组，每组10只。正常组和模型组予0.9%氯化钠溶液10 mL/(kg·d)灌胃，立普妥组予立普妥2 mg/(kg·d)灌胃，消瘀泄浊饮组予消瘀泄浊饮9.6 g/(kg·d)灌胃。各组均连续灌胃8周。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 各组大鼠一般情况 观察各组大鼠精神状态、进食、大小便及体质量的变化，同时观察记录死亡情况。

2.2.2 肾功能指标检测 末次给药后24 h,禁食不禁水，各组大鼠用3%戊巴比妥(30mg/kg)麻醉后腹主动脉取血2 mL，3 000 r/min离心15 min后-20 ℃保存，采用全自动生化分析仪检测SCr、BUN水平。

2.2.3 免疫组化检测主动脉Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白表达 大鼠处死后，取部分主动脉组织用4%多聚甲醛溶液常规固定，脱水、石蜡包埋，按二部法进行操作，采用ABC染色法，棕黄色为阳性染色区，每张切片400倍光镜下随机采集5个不重叠视野，棕黄色为阳性染色区，测量阳性染色面积；以德国Leica彩色病理图像分析系统对阳性反应产物进行半定量分析，计算出总光密度=∑阳性染色面积(Area)×该部位的平均光密度(Density)，以阳性染色面积和总光密度为参数进行分析。

2.2.4 实时荧光定量PCR(qPCR)检测Ubc、Ube2b、PsmA1mRNA表达 大鼠处死后，每组大鼠根据体质量按随机数字表法取6只进行检测。取部分主动脉组织用-70℃冰箱保存。实时荧光定量PCR各步骤严格按照试剂盒说明书操作。PCR引物系列参照文献。见表1

表1 PCR引物序列

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况观察 正常对照组大鼠体质量增长明显，精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽，进食及二便正常。模型组在5/6肾切除后死亡1只，体质量较正常对照组增长减缓，精神状态及反应速度较正常对照组欠缺；造模各组在给予高脂饮食后，体质量增长明显，皮毛光泽，饮食亢进。在给药期间立普妥组无死亡，模型对照组和中药组各有1只大鼠死亡。

3.2 各组大鼠血SCr、BUN水平比较 见表2。

表2 各组大鼠血SCr、BUN水平比较

3.3 各组大鼠主动脉MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白表达的免疫组化检测结果 见表3，图1。胞浆内的棕黄色颗粒沉淀为阳性表达。

表3 各组大鼠主动脉MMP-9、Ubc、 Ube2b、PsmA1蛋白表达总光密度比较

图1 各组大鼠主动脉MMP-9、Ubc、Ube2b、PsmA1表达的免疫组化检测结果(×400)

3.4 各组大鼠主动脉UPP各组分mRNA表达的比较 见表4。

表4 各组大鼠主动脉UbC、Ube2b、PsmA1 mRNA相对表达量的比较

4 讨论

中医学认为慢性肾衰竭以正气亏虚为本，湿浊、血瘀等病理产物为标，属中医“溺毒”“虚痨”“关格”等范畴,病机总属本虚标实。其中瘀浊是慢性肾衰的主要病理环节, 而瘀浊蕴毒是慢性肾衰进展的重要病机。慢性肾衰竭本虚表实的基本病机状态，也促进了动脉粥样硬化的形成。在先前的研究中笔者发现消瘀泄浊饮在延缓慢性肾衰竭的同时可以改善脂代谢紊乱，消瘀泄浊饮组大鼠主动脉动脉粥样硬化病理改变较模型对照组轻[6]。本实验主要从对主动脉泛素-蛋白酶体通路的影响，探讨消瘀泄浊饮抗慢性肾衰竭动脉粥样硬化的作用机制。

粥样硬化性动脉与正常动脉结构显著的区别在于动脉硬化(AS)的形成中涉及广泛的细胞外基质的重建。在动脉粥样硬化形成过程中基质金属蛋白酶系统起着重要作用[8]。本实验免疫组化结果显示消瘀泄浊饮组大鼠主动脉组织的MMP-9表达水平较模型对照组显著减少，阿托伐他汀组主动脉组织的MMP-9表达水平也较模型对照组显著减少；表明消瘀泄浊饮跟阿托伐他汀同样可以通过抑制MMP-9的表达稳定动脉粥样硬化斑块，减轻细胞外基质重构，延缓粥样硬化进展。

泛素-蛋白酶体系统是细胞中主要的蛋白分解机制的一部分，参与细胞内蛋白的降解；这些系统也与细胞事件有关，包括免疫细胞和细胞周期中的抗原呈递[9-10]。目标分子的多泛素化引发蛋白酶体降解，是由泛素激活酶E1、泛素交联酶E2和泛蛋白连接酶E3驱动的[11]。在泛素化过程中，泛素化靶蛋白被蛋白酶体复合物识别并被蛋白水解为肽。在这个过程中，由调控粒子19S和核心粒子20S组成的26S蛋白酶体在蛋白酶体系统中起着至关重要的作用[12]。与自噬系统相似，功能失调的蛋白酶体可引起退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和动脉粥样硬化[13-14]。研究表明泛素蛋白酶体的活化在尿毒症加速动脉粥样硬化中起到重要的作用，泛素蛋白酶体抑制剂能起到较好的防治作用[15]。在体外研究中发现，用尿毒症患者血清培养的主动脉平滑肌细胞中泛素-蛋白酶体途径相关组分表达增强[16]。

本研究免疫组化法以及实时荧光定量PCR检测结果显示：相比正常组，模型组主动脉Ubc、Ube2b、PsmA1蛋白以及mRNA表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)，表明泛素-蛋白酶体通路活性上调；中药消瘀泄浊饮UPP相关组分蛋白及mRNA表达与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。由此认为下调主动脉UPP相关组分的表达，是消瘀泄浊饮治疗慢性肾衰竭动脉粥样硬化的重要机制之一。