冯敏，郏自明，万鸣，樊柏林，唐晓荞，程文华，孙凡中*

（1.湖北省疾病预防控制中心应用毒理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430075；2.湖北省中医院药事部，湖北 武汉 430074）

学习和记忆是大脑重要的神经功能，《春秋纬元命苞》提到“脑之为言在也，人精在脑”，即人之精明是因为脑具有学习记忆功能[1]。阿尔兹海默症和脑外伤被认为是导致学习记忆功能障碍的主要原因，随着人口老龄化进程加快和环境的逐渐恶化，中枢神经退行性疾病发病率逐年升高，因其发病原因多样且机制复杂，单纯的西药干预较难取得显著的治疗效果。因此，从传统中药中寻找有效成分，利用其天然营养价值，开发相关食品成为研究热点。茯苓是我国传统中药“四君八珍”之一，为多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾胃、宁心安神的功效。大量研究表明[2-4]，茯苓还具有抗炎、保肝、增强免疫力等作用，不同部位提取物因其化学成分不同，功效也存在差异。目前，茯苓多与其它中草药配伍，以发挥改善学习记忆能力的作用，李牧函等[5]研究发现，以茯苓为主要成分的开心散具有改善阿尔兹海默症小鼠学习记忆能力的作用。同时，金苹等[6]研究发现，磷脂酰丝氨酸/茯苓组合可通过保护神经元途径改善学习记忆能力。然而，因方剂成分复杂，功效往往不太稳定，成分单一的单味茯苓功效可能更佳，但单味茯苓及其不同方式提取物对学习记忆功能的改善作用目前鲜有报道。茯苓属于兼性寄生菌，茯苓菌生长依赖松木提供养分，传统的种植方法需要大量砍伐松树作为材料，不利于环境保护。为了使环境免遭破坏，研发出一种不用松木栽培茯苓的新方法，即将植物秸秆或枝条粉碎后，与松木屑、米糠、蔗糖、熟石膏等混匀，模拟松木环境和营养成分，制成菌袋后接种茯苓菌种，该方法能在保护松林资源的同时缩短采收期，大大增加了茯苓的生产效率[7]。但以此方法生产的代培茯苓功效是否和传统方式栽培的茯苓一致，还需要进一步研究比较。本研究通过水迷宫实验、跳台实验和避暗实验，探讨生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物对小鼠学习记忆功能的改善作用，旨在为使用茯苓及其不同方式提取物开发相关食品及药品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

130只SPF级昆明种雌性小鼠，18 g～22 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2020-0018，实验动物质量合格证号：No.42000600035140。动物饲养于屏障系统的独立通气笼具（individual ventilated cages，IVC）中，于恒温恒湿（温度 20℃～25℃、湿度40%～70%）环境下，12 h明暗交替饲养。

1.2 原料及试剂

茯苓（批号：20171028）：市售，由湖北省中医院中药新药研发中心万鸣副研究员鉴定、提取。茯苓样品包括生茯苓粉（批号20171101-1）、熟茯苓粉（批号20171101-2）、茯苓代培粉（批号 20181010）、茯苓水提物（批号20180712，提取得率2.8%）、茯苓醇提物（批号20180715，提取得率1.7%）；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC）：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

ZH-1型自动记录水迷宫、ZH-600型小鼠避暗仪、YLS-3TB型跳台记录仪：安徽省淮北市正华生物仪器设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

将130只小鼠随机分为13组，每组10只，即阴性对照组，生茯苓粉低、高剂量组，熟茯苓粉低、高剂量组，茯苓代培粉低、高剂量组，茯苓水提物低、中、高剂量组，茯苓醇提物低、中、高剂量组。依据茯苓的人群推荐生药量10 g/（人·d），按体表面积换算动物等效剂量，小鼠等效剂量为1.3 g/（kg·d）。设置茯苓粉低、高剂量组小鼠给药剂量分别为0.13、4.00 g/kg，茯苓水提物低、中、高剂量组小鼠的给药剂量分别为0.04、0.12、0.36 g/kg，茯苓醇提物低、中、高剂量组小鼠的给药剂量分别为0.02、0.06、0.18 g/kg。阴性对照组给予等体积的0.5%CMC。每天灌胃给药1次，连续30 d。

1.4.2 水迷宫实验

参考文献[8]的方法，于末次给药次日开始训练，第一次训练使小鼠自动爬梯3次，以后每次训练使小鼠背朝楼梯，自动爬梯1次，根据小鼠学习成绩，逐步加长路程。第一次训练从A点开始，记录小鼠从A点到达终点的时间；第二次训练从B点开始，加长路程，训练3次至80%以上动物在2 min内达到终点后，继续延长路程，分别记录各小鼠每次从B点到达终点所需时间和发生错误的次数（进入任何一个盲端一次均算一次错误）；末次测试从起点进行，记录从起点到达终点所需的时间和发生错误的次数。为达到训练目的，应引导2 min内未完成训练的小鼠到达终点。每次训练或测验时各小鼠头朝起始点，最后计算各组小鼠5次训练和测试的总错误次数，到达终点的总时间及2 min内到达终点的总小鼠数（2 min内到达终点的小鼠数占该组小鼠总数的百分率），停止训练5 d后（包括第5天），于不同时间从起点进行记忆消退实验。

1.4.3 跳台实验

参考文献[8]的方法，于末次给药次日开始训练，将小鼠放入反应箱内铜栅上，立即通以36 V的交流电使小鼠受到电击，记录5 min内各小鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。24 h后开始测验，记录各小鼠第一次跳下平台的潜伏期、3 min内电击次数以及受电击的小鼠总数，同时计算出现错误反应小鼠的百分率（受电击的小鼠数占该组小鼠总数的百分率）。停止训练5 d后（包括第5天）进行一次记忆消退实验。

1.4.4 避暗实验

参考文献[8]的方法，于末次给药次日开始训练，将小鼠背向洞口放入明室，同时启动计时器，小鼠穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，记录各小鼠从放入明室至遭电击所需的时间，记为潜伏期，训练5 min，并记录5 min内电击次数。24 h后开始测验，记录每只小鼠进入暗室的潜伏期和5 min内的电击次数，并计算5 min内进入暗室（错误反应）的小鼠百分率（进入暗室的小鼠数占该组小鼠总数的百分率）。停止训练5 d后（包括第5天）进行一次记忆消退实验。

1.5 统计方法

采用SPSS20.0软件分析数据，结果用平均值±标准差表示。各组数据均采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水迷宫实验结果

水迷宫实验中，茯苓对小鼠记忆获得的影响见表1、表 2。

表1 茯苓对水迷宫实验小鼠记忆获得影响Table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

续表1 茯苓对水迷宫实验小鼠记忆获得影响Continue table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

表2 茯苓对水迷宫实验小鼠记忆消退的影响Table 2 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in water maze experiment

由表1和表2可知，记忆获得期和记忆消退期各组小鼠到达终点的时间与阴性对照组比较均无显著差异；部分茯苓组小鼠记忆获得期到达终点前错误次数与阴性对照组比较显著增加（P<0.05），而记忆消退期均无显著差异；部分茯苓组小鼠记忆获得期2 min内到达终点的小鼠数与阴性对照组比较显著增加（P<0.05），以上结果说明茯苓对小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用，但若需更显著的效果出现，可能还需更长时间的干预。

2.2 跳台实验结果

跳台实验中，茯苓对小鼠记忆的影响结果见表3～表5。

表3 茯苓对跳台实验训练期小鼠记忆的影响Table 3 Effect of Poria cocos on memory of training mice in diving platform experiment

表4 茯苓对跳台实验测验期小鼠记忆的影响Table 4 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the diving platform experiment

表5 茯苓对跳台实验小鼠记忆消退的影响Table 5 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in diving platform experiment

由表3～表5可知，茯苓组各组小鼠训练期的潜伏期与阴性对照组比较均缩短，错误次数与错误反应率无显著差异；部分茯苓组小鼠测验期和记忆消退期错误反应率显著降低（P＜0.01），潜伏期和错误次数无明显改善。以上结果说明茯苓对小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用，但与其提取方式和剂量相关。其中生茯苓粉高剂量组、熟茯苓粉高剂量组可显著降低测验期错误反应率，效果较佳；生茯苓粉高剂量组、熟茯苓粉各剂量组、茯苓代培粉高剂量组、茯苓水提物中剂量组可显著降低记忆消退错误反应率，生茯苓粉高剂量组和茯苓代培粉高剂量组小鼠记忆消退潜伏期显著延长。但这些茯苓组对学习记忆能力的改善要出现显著差异，需进行更长时间的干预。

2.3 避暗实验结果

避暗实验中，茯苓对小鼠记忆的影响结果见表6～表8。

表6 茯苓对避暗实验训练期小鼠记忆的影响Table 6 Effect of Poria cocos on memory of training mice in avoid dark experiment

表7 茯苓对避暗实验测验期小鼠记忆的影响Table 7 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the avoid dark experiment

表8 茯苓对避暗实验小鼠记忆消退的影响Table 8 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in avoid dark experiment

由表6～表8可知，茯苓代培粉低剂量组、茯苓醇提物低剂量组的测验期错误反应率与阴性对照组相比显著降低（P＜0.05），但记忆消退期各茯苓组错误反应率均显著升高（P＜0.05），说明茯苓可在一定时间和剂量范围内发挥显著作用，随着干预时间的延长会逐渐失去功效，可能与其毒理作用的表现有关。

3 讨论

根据茯苓的药理特性，分析其改善学习记忆功能的作用机制可能有以下两个方面：一方面可以调控中枢胆碱能神经系统。有研究表明[9-10]，茯苓可有效降低大脑乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase，AchE）活性，提高小鼠脑指数，从而改善学习记忆能力。乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）参与协调大脑皮层情绪和运动等功能，是中枢神经中重要的神经递质，影响着机体的学习和认知能力，AchE通过水解ACh控制胆碱神经元突触间的信息传递，进而调控脑功能[11]。另一方面抑制过氧应激反应。Benzi等[12]研究发现，过氧化应激增强是导致老年痴呆症的重要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）控制着机体氧化与抗氧化平衡，丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性的高低可以反映机体内氧自由基水平和细胞损伤程度，茯苓可通过提高SOD活性降低MDA活性，加速清除体内自由基，从而减少过氧应激反应对机体的损伤，改善学习记忆能力[13]。

4 结论

本研究结果表明，生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物均具有改善小鼠学习记忆功能的作用，其中茯苓代培粉既可增强水迷宫实验中小鼠记忆获得能力，又可降低跳台实验中小鼠错误反应率、延长记忆消退潜伏期，还能降低避暗实验中小鼠错误反应率，其对小鼠的学习记忆功能改善作用最佳。综上所述，茯苓具有改善小鼠学习记忆功能的作用，其机制可能与调控中枢胆碱能神经系统和抑制过氧应激反应有关，以茯苓为主要成分开发食品或药品，将在预防中枢神经退行性疾病领域具有较大的社会价值。