许泳清 李华伟 张鸿 李国良 林赵淼 邱永祥 邱思鑫

摘要：【目的】建立快速检测甘薯卷叶病毒重组酶聚合酶（ RPA）等温扩增方法，为甘薯卷叶病毒（sweet potatoleaf curl virus，SPLCV）提供快速、简便的检测方法。【方法】根据甘薯卷叶病毒AV1基因的保守区段设计RPA检测用引物，并对引物进行筛选，对反应条件和反应体系进行优化，建立SPLCV的RPA检测方法。【结果】建立的甘薯卷叶病毒RPA方法快速简便，39℃反应20 min完成检测;灵敏度高，最低检测限为10 pg· uL-1;特异性强，与感染番茄黄化卷叶病毒（ TYICD），甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯退绿矮化病毒（ SPCSV）等4种DNA病毒均无交叉反应。【结论】建立的RPA检测方法具有快速、灵敏、特异性强、小需要特殊仪器等优点，适合田问甘薯卷叶病毒样品的快速检测。

关键词：甘薯;卷叶病毒（ SPLCV）;重组酶聚合酶等温扩增方法;检测

中图分类号：S 435

文献标志码：A

文章编号：1008-03 84（ 2021） 08092304

A Rapid Detection Method on RPA of Sweet Potato Leaf Curl Virus

XU Yongqing， LI Huawei， ZHANGHong. LI Guoliang， LIN Zhaomiao， QIU Yongxiang， QIU Sixin*（ Crop Research Institute . Fujian Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experimentation Station on Tuber andRoot Crops in South China. Ministry of Agriculture/Dry Crop Engineering Research Center ofFujian Province. Fuzhou Fujian 3500 13. China ）

Abstract： 【Objective】 A rapid isothermal amplification method for detecting the recombinant enzyme polymerase （RPA） insweet potato leaf curl virus （SPLCV） was established. 【Method】 A set of primers for RPA detection was designed based onthe AVl gene selected from SPLCV sequence. Reaction conditions for the detection was optimized and verified forapplicability. 【Result】The newly established methodology took merely 20m to complete the nucleic acid amplification at39℃， which greatly improved the detection efficiency.

More importantly， the method was specific toward SPLCV and free ofany cross reaction with DNAs of other pathogens， such as TYLCD. SPFMV. SPVG. or SPCSV. It also showed a highrepeatability and a minimum detection limit on RPA of 10 pg·yL-1. 【Conclusion】The newly developed method for SPLCVidentification based on the detection of RPA in sweet potatoes was rapid， accurate， specific， repeatable. and easy to operate inthe field.

Key words： Sweet potato; sweet potato leaf curl virus （SPLCV）; RPA; detection methodology

0 引言

【研究意义】甘薯是以块根或秧蔓进行繁殖的无性繁殖作物，常会受到病毒的侵染，病毒侵染甘薯后会继代相传，从而影响甘薯的正常生长发育，造成种性退化。而甘薯卷叶病毒（Sweet potato leafcurl virus.SPLCV）是由烟粉虱（Bermisia tabaci）以持久方式传播并侵染甘薯的最主要病毒之一[1-2]。据调查发现，甘薯的产区每年均有发生危害，发生严重的导致甘薯绝产，对薯农的收益造成巨大影响。甘薯卷叶病毒属双生病毒科（ Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒属（Begomovirus）成员，SPLCV是典型的DNA病毒[3]。SPLCV侵染甘薯后，甘薯植株会出现叶片卷曲、坏死、花叶等症状。近年来，随着各地之间种苗交换频繁，在山东、河北、河南、广东、江苏和福建等地均有甘薯曲叶病毒发生的报道[4-6]。目前，生产上还没有特效药防治病毒病，因此，亟需建立一种速度快、效率高、实用强的检测方法，应用于大田生产，加强监测和防控，为甘薯病毒病的防治奠定基础。【前人研究进展】目前检测双生病毒有传统方法和聚合酶链式反应（ Polymerasecham reaction，PCR）分子检测方法。传统的血清学检测假阳性率较高，PCR检测方法需要昂贵的专业仪器，且扩增时间较长，不适合野外及基层单位应用。环介导等温扩增技术（ loop-mediated isothermalamplification，LAMP）是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测技术[7]，该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用DNA链置换聚合酶（BstDNApolymerase）在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但LAMP在检测过程中会产生气溶胶，出现假阳性。2006年英国TwistDx Inc公司新研发了重组酶聚合酶扩增（ Recombinase PolymeraseAmplification RPA）技术，该技术被公认为可以代替传统的PCR核酸检测技术[8]。近年来RPA广泛应用于很多病原菌的检测。Boyle等[9]开发出一种实时的RPA方法，可以快速、灵敏检测结核分歧杆菌的目标基因。Daher等[10]研究表明RPA能够在20 min内检测出孕妇体内是否感染B链球菌，同时可以实现多重检测。【本研究切入点】由于RPA检测技术灵敏、特异、快速（检测时间缩短至20 min）不需要特殊仪器等优点，在动植物病原菌检测上得到了广泛的应用[11-13]。而应用该技术在甘薯病原物的检测尚待深入研究，建立甘薯病毒RPA快速检测技术在甘薯病毒病快速诊断具有广泛的应用前景。【拟解决关键问题】根据甘薯卷叶病毒AVI基因的保守区段设计一对RPA检测用引物，并对反应条件和反应体系进行优化，以期建立SPLCV的RPA检测方法。

1材料与方法

1.1材料及DNA提取

试验于2019- 2020年在福建省农业科学院作物研究所进行。感染SPLCV的样品（甘薯叶片组织）采集于福建省福州市福建省农业科学院作物研究所和莆田市秀屿区，样品用液氮处理后保存于80℃超低温冰箱中备用。

将被SPLCV侵染和健康的組织进行DNA提取，以健康组织提取的DNA为阴性对照。采用CTAB法提取DNA，提取试剂盒购白北京全式金生物技术有限公司。

1.2引物设计与合成

根据GenB ank公布的SPLCV较保守的AV1基因序列为靶标基因，应用primer 5.0引物设计软件设计1对特异性引物。并由福州尚亚生物技术有限公司合成（表1）。

1.3 RPA反应体系的建立

RPA反应体系50 uL，其中含模板DNA 2 uL，Rehydration Buffer 29.5 uL、引物F和R各2.4 uL、ddH20 11.2 uL、最后再加入醋酸镁溶液（MgOAc）2.5 uL（ 280 mmol·L-1），50 uL反应体系加入冻干酶粉中，39℃反应20 min。冰上终止反应。取5uL RPA产物以2%琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在0.5×TBE和120 V电压下电泳40 min，用紫外透射仪观察。

1.4 RPA特异性及灵敏度检测

提取感染甘薯卷叶病毒（ SPLCV）阳性样品、番茄黄化卷叶病毒（ TYICD）阳性样品的总DNA，甘薯羽状斑驳病毒（ SPFMV）阳性样品、甘薯G病毒（ SPVG）阳性样品、甘薯退绿矮化病毒（SPCSV）阳性样品的cDNA，利用RPA反应体系对其进行特异性检测。对提取感染SPLCV的DNA样品采用10倍浓度进行稀释，进行RPA反应进行灵敏度检测。

2 结果与分析

2.1甘薯卷叶病毒RPA反应体系的建立

设计了9对甘薯卷叶病毒RPA扩增引物，筛选到1对扩增效果较好的引物SPLCV（ RPA）F和SPLCV（ RPA）R，扩增大小为500 bp左右，和设计引物片段大小一致，产物经过测序，片段大小为464 bp，证明扩增片段为甘薯卷叶病毒的特异序列（图1）。利用该引物进行RPA程序优化，最终为RPA反应体系50 uL，模板DNA 2 uL（4 ng·uL-1），RehydrationBuffer 29.5 uL、引物F和R各2.4 uL（0.48 umol·L-l）、ddH20 11.2 uL、醋酸镁溶液（MgOAc） 2.5 uL（ 280mmol·L-l），50 uL反应体系加至冻干酶粉中，39℃反应20 min。

2.2甘薯卷叶病毒RPA特异性检测

用建立的RPA反应体系检测SPLCV、番茄黄化卷叶病毒（ TYLCD）、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯G病毒（ SPVG）和甘薯退绿矮化病毒（SPCSV）。取5 uL产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，具体结果如图2所示，只有SPLCV检测结果有特异性条带，其他样品不产牛特异条带，说明建立的RPA检测方法对SPLCV的检测具有较好的特异性。

2.3甘薯卷叶病毒RPA灵敏度检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的甘薯卷叶病毒DNA稀释成10 ng·uL-l、1 ng·uL-l、100 pg·uL-l、10 Pg·uL-l、1 pg·uL-l、100 fg·uL-1、10 fg·uL-l、1fg·uL-l共8个不同质量浓度梯度，进行RPA反应。在RPA反应结束后，取5uL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示：甘薯卷叶病毒RPA灵敏性检测，琼脂糖凝胶电泳出现RPA特异性带，检测灵敏度可达10 pg·uL-l，这与普通PCR灵敏度相当。

3讨论与结论

目前用于甘薯卷叶病毒检测的方法主要有酶联免疫吸附测定法、PCR法、QPCR法和LAMP法等，但是，常规PCR及QPCR检测技术需要专业仪器并由分子生物学专业实验人员操作，检测时间长，操作复杂。LAMP恒温扩增技术需针对靶基因的6个位点设计出4条引物，并且在较高的恒温条件下（ 60～65℃）保温60～90 min进行反应，引物设计复杂，扩增时间长，且易出现假阳性等缺点。RPA检测技术重组酶聚合酶扩增技术（ Recombinase polymeraseamplification，RPA）是英国TwistDx公司开发的一种新型等温扩增技术，是DNA诊断领域的革命性突破。该技术与RT-PCR和QRT-PCR扩增技术比较，不需要借助昂贵的仪器设备，具有操作简便、检测效率高，只需要在37～42℃的恒温条件下反应20～40 min即可完成检测任务。目前该技术在医学、食品安全检测和农业等领域被广泛应用[14-16]。

本研究根据甘薯卷叶病毒AV1基因的保守区段设计了一对RPA检测用引物，并对反应条件和反应体系进行优化，最终建立了SPLCV的RPA快速检测方法。本研究建立的RPA检测方法具有快速、灵敏、特异性强、不需要特殊仪器等优点，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯无毒种苗的健康生产。

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（责任编辑：林海清）

收稿日期：2021-0524初稿：2021-0630修改稿

作者简介：许泳清（ 1980-），女，副研究员，研究方向：薯类作物脱毒培养与病毒检测（ E-mail： 123071729@qq.com）

*通信作者：邱思鑫（ 1974-），男，博士，研究员，研究方向：植物病理学（E-mail： qiusixin@faas.cn）

基金项目：福建省科技计划公益类专项（2020Rl031008）;国家现代农业产业技术体系项日（CARS—lO-Bl4）;福建省种业创新与产业化工程项日（ zvcxny2021005）：农业高质量发展超越“5511”协调创新工程项日（KXXYJBG0039）：福建省农业科学院农业科技创新联盟专项（CXLM2021001）