杜杏蓉，李运国，邓小鹏，李军营，姜永雷，童文杰，欧阳铖人，赵正雄，王娜

摘  要：为探明不同类型植烟土壤对连作的响应差异，以云南的红壤、水稻土和紫色土为研究对象，分析烤烟连作5年土壤化学指标、酶活性和细菌群落特征的变化。结果表明，连作5年后，与轮作处理比较，水稻土和红壤的有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷含量显著增加，pH、速效钾含量显著降低，紫色土仅速效钾含量显著增加，其他指標无明显变化。3种土壤的过氧化氢酶活性显著下降，脲酶活性不同程度增加，但紫色土增加不显著;水稻土的蔗糖酶活性显著下降，红壤和紫色土则变化不明显。3种类型土壤均以变形菌门、蓝细菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和拟杆菌门等5个菌门为优势菌群。连作5年后，不同类型土壤的细菌群落相对丰度与活性存在一定差异，其中紫色土的细菌群落结构组成与轮作处理最为相似，其ACE和Shannon指数在3种土壤中变幅较小。综合比较来看，烤烟连作对紫色土的主要生化指标微生物群落结构影响较小，说明紫色土对烤烟连作响应相对不敏感。

关键词：土壤类型;连作;化学性状;酶活性;细菌群落

Effects of Continuous Cropping on Chemical Properties， Enzyme Activities and Bacterial Communities in Different Types of Tobacco-Planted Soil

DU Xingrong1， LI Yunguo1， DENG Xiaopeng2， LI Junying2， JIANG Yonglei2， TONG Wenjie2，

OUYANG Chengren1， ZHAO Zhengxiong1， WANG Na1*

（1. College of Tobacco Science， Yunnan Agriculture University， Kunming 650201， China; 2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653199， China）

Abstract： In order to find out the difference in response to continuous cropping of three tobacco-planted soil types， taking red soil， paddy soil and purple soil in Yunnan Province as research objects， the changes of soil chemical indexes， enzyme activities and bacterial community characteristics under continuous cropping flue-cured tobacco for 5 years were analyzed. The results showed： after 5 years of continuous cropping， compared with the rotation treatment， the contents of organic matter， total nitrogen， total phosphorus， alkali hydrolyzable nitrogen and available phosphorus of paddy soil and red soil increased significantly， and the contents of pH value and available potassium decreased significantly， meanwhile only the content of available potassium of purple soil increased significantly， and other indexes did not change significantly. The catalase activity of the three soil types decreased significantly， the urease activity increased in varying degrees， but the increase of purple soil was not significant. The sucrase activity of paddy soil decreased significantly， and the change of red soil and purple soil were not obvious. The dominant flora of the three soil types were proteobacteria， cyanobacteria， acidobacteria， chloroflexi and bacteroidetes. After 5 years of continuous cropping， there were some differences in the relative abundance and activity of bacterial communities of different soil types. The structural composition of bacterial communities in purple soil was the most similar to that in the rotation treatment， and the changes of ACE and Shannon index were smaller in the three soil types. Comprehensive comparison showed that continuous cropping of flue-cured tobacco had little effect on the main biochemical indexes and microbial community structure of purple soil， indicating that purple soil was relatively insensitive to continuous cropping of flue-cured tobacco.

Keywords： soil type; continuous cropping; chemical property; enzyme activity; bacterial community

近年来我国烤烟种植区域不断压缩，烤烟连作现象愈加严重，连作障碍已成为制约我国烟草产业可持续发展的重要因素[1-2]。前人研究表明，长期连作可导致烤烟土壤理化性状恶化、养分比例失调、酶活性受到抑制、微生物群落特征明显改变[3-7];同时这些环境因子相互作用对土壤环境产生综合影响，导致病虫害加剧和植株的减产降质。目前关于

不同类型土壤对烤烟连作耐受性的差异研究鲜见报道。为此，本研究选择云南3类典型植烟土壤——红壤、紫色土和水稻土，分析烤烟连作对其化学性状、酶活性指标及微生物群落结构与丰度的影响，旨在探讨不同土壤类型对烤烟连作的响应差异，为不同土壤类型的连作耐受性研究提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  试验地基本情况

试验于2014—2019年在红壤、紫色土和水稻土的长期定位植烟试验田进行，其基础化学性状见表1。红壤田位于云南省寻甸县河口镇双龙村水井村民小组（N25°41′19″，E103°26′13″，海拔2020 m），紫色土田位于石林县鹿阜镇阿乌村干山冲村民小组（N 47°33′13″，E 157°23′15″，海拔1970 m），水稻土田位于云南省石林县板桥镇板桥村虎街村民小组（N 25°17′48″，E 103°21′51″，海拔1950 m）。土壤质地均为壤土，烤烟品种均为云烟87，连作采用了“烤烟-小麦→烤烟-小麦”的复种连作模式;作为对比的轮作采用了“烤烟-小麦→玉米-小麦”的复种轮作模式。红壤田每年烤烟施纯氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶2∶2，施农家肥500 g/株;紫色土田每年烤烟施纯氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1∶2.5;水稻土田每年烤烟施纯氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶2∶2。连作模式下每年小麦施纯氮82.5 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.4∶1。轮作模式下每年小麦施纯氮67.5 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.4∶1;玉米施纯氮180 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.38∶0.47。烤烟的栽培管理方法均按照当地优质烟叶生产技术规程执行。

1.2  土樣采集

水稻土代号为A、紫色土代号为B，红壤代号为C，轮作处理编号为0，连作5年处理编号5，每个处理3次重复，每个小区面积为0.067 hm2。2019年于烤烟成熟期在每个小区随机选取3个点，去除地表凋落物，采集表层土样（利用环形取土器取土，直径3 cm，深度0～20 cm），充分混均匀后采用四分法留取1.5 kg。土壤样品采集后过2 mm筛，然后分为两份：一份风干后用于土壤理化性状和酶活性的测定;另一份在液氮中速冻后置于–80 ℃低温保存，用于土壤细菌的测定。

1.3  测定项目与方法

1.3.1  土壤化学指标测定  pH测定采用美国SPECTRUM公司IQ150 pH仪，有机质测定采用重铬酸钾氧化法，全氮测定采用高氯酸-硫酸消化、半微量开氏蒸馏法（NY/T53—1987），全磷测定采用高氯酸-浓硫酸消化、钼蓝比色法（NY/T 88—1988），全钾测定采用NaOH熔融-火焰光度计法（NY/T 87—1988），碱解氮测定采用碱解扩散法（LY/T 1229—1999），有效磷测定采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法（NY/T 1121.7—2006），速效钾测定采用醋酸铵浸提-火焰光度计法（NY/T 889—2004）[8]。每个测定指标均设置3次重复。

1.3.2  土壤酶活性测定  过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法，脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法[9]。每个指标测定均设置3次重复。

1.3.3  土壤细菌群落结构和多样性测定  使用PowerSoil DNA提取试剂盒，从1.0 g土壤样本中提取基因组DNA;用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳测定DNA分子量。将DNA保存在–20 ℃以进行PCR扩增。用细菌V4-16S rRNA基因特异性引物515F和806R进行PCR扩增。通过Illumina MiSeq PE300平台进行测序。

使用SILVA 16S数据库作为细菌参考数据库，将过滤后的Tags进行拼接，以97%的相似度为界，聚类成可操作分类单元（OTUs），并对OTUs代表性序列进行注释[10]。

1.4  数据处理与统计分析

数据处理、统计分析制图运用IBM SPSS Statistics 24.0和Microsoft Excel 2010进行。

2  结  果

2.1  烤烟连作对不同类型植烟土壤化学指标的影响

由表2可知，相较轮作而言，烤烟连作5年后，3种土壤的pH呈不同程度降低，水稻土和红壤的pH分别显著下降2.20和1.26，紫色土pH仅降低0.42，降低不显著;水稻土和红壤的有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷含量均显著增加，紫色土的有机质、全氮含量增加不显著，仅增加了1.68、0.01 g/kg，其全磷、碱解氮和有效磷含量略有下降，分别下降了0.07 g/kg、1.80 mg/kg、0.63 mg/kg，降低不显著;水稻土和红壤的速效钾含量显著下降，分别降低了340.67、72.33 mg/kg，紫色土速效钾含量则显著增加了120.00 mg/kg;红壤全钾含量显著下降了15.53 g/kg，水稻土的全钾含量则增加了1.36 g/kg，增加不显著，紫色土全钾含量仅下降了1.03 g/kg，降幅不显著。

2.2  烤烟连作对不同土壤酶活性的影响

由表3可知，相较轮作而言，烤烟连作5年后，3种土壤的过氧化氢酶活性均显著下降，其中，紫色土的降幅最小为6.06%;水稻土的蔗糖酶活性显著下降了7.08 mg/（g·d），紫色土仅下降了0.17 mg/（g·d），下降不显著，红壤的蔗糖酶活性则增加了0.42 mg/（g·d），增加不显著;3种土壤的脲酶和磷酸酶活性均有所增加，其中，紫色土脲酶活性增幅最小，为0.01 mg/（g·d），增加不显著，但其磷酸酶活性则增幅最大，显著增加了1.66 mmol/（g·h）。

2.3  烤烟连作土壤细菌群落结构和多样性变化特征分析

2.3.1  细菌群落结构变化  利用Mothur方法将所有处理土样的门水平细菌分为41种（图1），并将相对丰度最大的前10种进行比较分析后发现，3种土壤共有的相对丰度最大的5个优势菌门为：变形菌门（Proteobacteria，占总测序数据的27.32%）、蓝细菌门（Cyanobacteria，占总测序数据的12.37%）、酸杆菌门（Acidobacteria，占总测序数据的19.82%）、绿弯菌门（Chloroflexi，占总测序数据的9.58%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，占总测序数据的8.10%），5个菌门共占总测序数据的77.19%。连作5年后，水稻土的酸杆菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）相对丰度较轮作处理明显降低，而蓝细菌门、变形菌门相对丰度却增加明显;紫色土的蓝细菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门（Actinobacteria）相对丰度明显降低，而绿弯菌门、拟杆菌门、酸杆菌门则明显增加;红壤的蓝细菌门相对丰度明显降低，但绿弯菌门、酸杆菌门和硝化螺旋菌门则明显增加。

2.3.2  细菌α多样性变化  由图2可知，16S rDNA扩增子测序的覆盖率（Coverage）均在95.5%以上，表明测序结果符合所取土壤样本中微生物的实际情况，且测序的长度符合后续分析要求。相较轮作而言，烤烟连作5年后，水稻土的Chao1指数、ACE指数分别显著下降了80.09%和80.48%，Shannon指数下降了43.68%，Simpson指数显著升高了97.15%;紫色土和红壤的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数则有所升高，其中，Chao1指数分别升高了14.77%和29.48%，ACE指数分别升高了14.47%和29.45%，Shannon指數分别升高了3.99%和9.83%，Simpson指数下降了3.99%和9.83%，且除紫色土的Chao1指数外，其余指数变化均不显著。综合以上结果来看，烤烟连作5年对水稻土细菌群落结构的丰度和多样性影响最大、红壤次之，紫色土影响最小，且连作导致水稻土细菌群落结构的丰度和多样性显著降低。

2.3.3  细菌β多样性变化  主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis， PCoA）结果显示（图3），第一坐标轴和第二坐标轴分别解释了细菌总变异数的32.35%和15.80%，共计48.15%。图3还表明，烤烟连作5年后，水稻土和红壤的细菌群落结构与轮作处理差异较大，细菌群落结构组成发生明显改变，且水稻土的变化大于红壤;紫色土的细菌群落结构相较而言变化较小，细菌群落结构组成与轮作最为相似。

3  讨  论

本研究发现连作导致了不同类型植烟土壤pH下降，这与白羽祥等[1]的研究结果一致。主要原因可能是连作条件下，每年投入的肥料养分一致，并且烟株对养分的选择性吸收相对固定，使得土壤胶体上吸附的H+或Al3+在土壤中逐年积累[11];并且土壤本身含有的非腐质如有机酸、氨基酸，以及烤烟根系和微生物的有机酸类分泌物，均会释放H+和酸性物质，使根区的pH下降[2]。

连作导致3种土壤的有机质、全氮、碱解氮和有效磷含量不同程度增加，这与王鹏[12]、王棋等[13]的研究结果相一致，即随着连作年限增加，部分养分会在土壤中积累，出现土壤养分含量增加的现象。

连作导致3种土壤的过氧化氢酶活性显著降低，磷酸酶、脲酶活性则不同程度地增强。该结果与蔡秋燕等[14]的研究结果不完全一致，其研究发现植烟连作土壤酶活性随连作年限的延长不同程度下降。分析原因可能与不同类型土壤的质地有关，不同质地的土壤其机械组成不同，而土壤酶活性与土壤黏粒含量呈正相关[15]，土壤质地越粘重，其土壤酶的活性越强，反之，土壤粒径越大，其土壤酶尤其是水解酶类活性越弱。

连作5年后，3种类型土壤的细菌群落结构虽然组成基本相似，但不同种类细菌的相对丰度却存在明显差异，这与前人研究结果相一致。齐虹凌等[16]研究表明，土壤类型对细菌、真菌、放线菌、古菌等微生物的生长发育与动态消长有较大影响。周赛等[17]研究认为，土壤类型对土壤微生物分布格局具有较大影响，其贡献率达60%。同时，水稻土的绿弯菌门、酸杆菌门和蓝细菌门等3个门水平的菌群相对丰度与红壤和紫色土的变化趋势相反，这可能是由于水稻土长期处于淹水条件下，土壤容重较大，透气性较差，与另外两种土壤的物理性状存在较大差异，进而影响了生活在其中的厌氧、好氧和兼性菌群的数量与活性;而淹水和好气条件下土壤微生物的群落结构是朝不同方向演替的，这与高林等[18]的研究结果一致。

本研究显示，烤烟连作5年后，3种土壤的化学性状、酶活性和细菌群落组成与结构，相较轮作而言均发生了一定改变，但不同土壤类型的变化趋势或程度是有差异的。连作导致了水稻土和红壤的主要化学指标、酶活性以及细菌群落组成和结构发生较大变化，而紫色土的变化相对不明显，紫色土对连作的耐受性相对较好。我们推测这可能与不同类型土壤的土壤恢复力有关，即土壤可以通过自身调节机制，在一定限度内抵抗外因胁迫而保持状态相对稳定。紫色土的土壤恢复力强于其余两种土壤，从而可为烤烟生长和土壤生物的活动提供一个相对稳定的土壤环境条件，而关于不同类型土壤恢复力强弱差异的内在机制和具体原因有待下一步深入研究。

4  结  论

本研究结果表明，与轮作相比，连作5年后3种类型植烟土壤的化学性状和酶活性均有不同程度的改变。其中水稻土和红壤的主要化学指标、酶活性以及细菌群落组成和结构发生较大变化，而紫色土对连作响应相对不敏感，其化学性状、酶活性指标相对稳定，细菌群落组成、丰度与多样性变化较小。紫色土对烤烟连作的耐受性相对较好。

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