张迎新，周宾寒，杨竹，丁富功，贾宝森，王超，方正武，王书平

1.主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025 2.长江大学农学院，湖北 荆州 434025

小麦(TriticumaestivumL.)是我国最重要的旱地粮食作物之一，其生长发育过程中常常受到各种生物胁迫(病害、虫害等)和非生物胁迫(干旱、高盐、渍害等)的影响。其中，小麦对渍害尤其敏感，渍害胁迫可导致小麦减产20%～50%[1-3]。长江中下游地区是我国冬小麦主产区之一，也是弱筋小麦的优势生产区。该区域受季风气候的影响，年平均降雨量丰富，地下水位整体偏高，土壤长期处于水分接近饱和的状态，且稻—麦两熟轮作制度使得土壤质地黏重，通气性差，这进一步加重了渍害的危害程度[4]。因此，如何有效地减轻小麦生育期内渍害胁迫所造成的损害一直是该种植区亟待解决的重要课题。研究发现，在小麦整个生育期内无论受渍害时间长短，均会使粒重、产量和品质下降[4,5]。周广生等[5]对孕穗期的12个小麦品种(系)进行渍害胁迫处理，发现所有品种(系)的单株粒重及单株总粒数均比对照大幅度下降，且单株粒重的影响均大于单株总粒数；宋桂成等[6]通过对渍害胁迫的34份小麦品种(系)进行分析后发现，渍害胁迫对所调查籽粒的品质性状、面团流变学特性及溶剂保持均有显著或极显著影响。此外，当小麦遭受渍害胁迫时，其自身的生理生化特性会发生适应性改变，并产生相应的生理响应机制，如形成一定数量通气组织[7]、增加次生根的数量[8]、通过无氧呼吸维持能量供应[9]等。更重要的是，渍害胁迫会对植株造成不可恢复的损伤，使小麦根系丧失功能[10]、限制水分传导[7,11]、降低光合作用[12]、打破氧化还原代谢平衡[4]等。

糖是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它为植物的生长发育提供必不可少的碳骨架和能量[13]。糖代谢是整个生物代谢的中心，与蛋白质代谢、脂类代谢、核酸代谢及次生物质代谢密切相关[14]。糖除了作为代谢底物之外，也与植物激素类似，在信号转导过程中可作为第一信使调节基因的表达、同化物的分配以及细胞的分裂、分化和代谢[15]。研究表明，渍害胁迫下光合作用形成的碳水化合物向根部的运输能力显著降低，根系蔗糖含量在短期渍害胁迫下呈现升高的趋势，而在长期渍害胁迫下则将快速耗竭[7]。此外，蔗糖在韧皮部的装载和长距离运输需要蔗糖转运蛋白(sucrose transporters，SUT)参与才能完成，该蛋白是一类典型的膜结合蛋白分子，广泛存在于高等植物的组织和细胞中，能够利用细胞内外H+浓度梯度对蔗糖分子进行跨膜转运[14]。目前已鉴定出的3个小麦蔗糖转运蛋白基因TaSUT1A、1B和1D，在小麦旗叶、茎和籽粒等多个组织中均有表达，并且3个基因的表达水平保持一致，这些基因编码的蔗糖转运蛋白参与了多个组织的蔗糖运输过程[16,17]。因此，对渍害胁迫下小麦幼苗糖代谢过程的研究具有重要的意义，可为揭示小麦响应渍害胁迫的机理提供重要理论依据。

该研究以幼苗期的小麦叶片为试验材料，分析了不同渍害胁迫持续时间对小麦幼苗叶绿素含量、可溶性糖含量和淀粉含量的影响，并比较了渍害胁迫下蔗糖转运蛋白基因TaSUT1A的表达水平，旨在研究和揭示渍害胁迫下小麦幼苗糖代谢的变化规律，探索小麦渍害胁迫响应机制，进而为缓解渍害对小麦的影响，确保小麦的高产和稳产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

供试小麦品种为郑麦9023。采用盆栽套桶法[4]，2019年10月下旬播种于相同规格的塑料盆中，盆口直径34cm，底直径30cm，高度27cm，土壤过筛与基肥混匀后装盆浇水(基肥用量为每千克干土0.15gN，0.1gP2O5和0.15gK2O)，待土自然沉实后播种，每盆选种播撒15粒，两叶一心期定植大致相同的植株10株，并于人工气候室中进行渍害胁迫处理，设置温度(25±1)℃，湿度为(70±5)%。处理组均在盆外再套一塑料桶，并保持水层在2cm左右。渍害胁迫处理设置5个持续时间，分别为0、1、3、5、7d。每处理重复3次。

1.2 叶绿素的提取

叶绿素的提取参照侯泽豪等[18]的方法并略加修改。取1g小麦叶片，置于预冷的研钵中，加入提取液5mL(丙酮∶乙醇=1∶1)和少量石英砂，研磨至匀浆状后，于25℃恒温摇床(110r/min，避光)下浸提20h，经过滤、洗涤后定容至25mL，并立即在645nm和663nm波长下测定其光密度值。设置3个生物学重复，每个重复测量3次。所得数据经Amon法修正公式[18]计算叶绿素含量。

1.3 可溶性糖及淀粉含量的测定

参照WANG等[19]的蒽酮比色法进行。绘制葡萄糖含量与光密度的标准曲线，在620nm波长下测定其光密度。设置3个生物学重复，每个重复测量3次。按以下公式分别计算可溶性糖及淀粉含量：

可溶性糖含量=(C×Vt×n)/(W×Vs×1000)

淀粉含量=(C×Vt×0.9)/(W×Vs×1000)

式中：C为查标准曲线所得每管葡萄糖含量，μg；Vt为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时取样体积，mL；W为样品干重，g；n为稀释倍数；1000为换算系数；0.9为葡萄糖换算为淀粉的系数。

1.4 荧光定量PCR分析

参考WANG等[20]的方法进行，并按照Trizol Reagent Kit(Invitrogen公司)的操作说明提取总RNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，依照反转录试剂盒PrimeScript TM RT Reagent Kit(TaKaRa公司)中操作说明进行cDNA合成。荧光定量PCR采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa公司)在CFX96RealTime PCR System上进行(见表1)，按照试剂盒的说明进行操作。设置3个生物学重复，每个重复测量3次。使用Actin基因作为内参基因，并利用2-△△Ct法[20]计算相对表达量。

表1 相关基因荧光定量PCR引物

1.5 统计分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，并用Origin 9.0软件进行差异显著性分析及绘制图表。

2 结果与分析

2.1 渍害胁迫对小麦幼苗叶绿素含量的影响

注：*表示处理间的差异显著(P<0.05)，**表示处理间的 差异显著(P<0.01)。图2、3同。图1 不同渍害胁迫持续时间下小麦幼苗的叶绿素含量Fig.1 The chlorophyll content of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

为了揭示渍害胁迫下小麦幼苗叶绿素的变化规律，研究采用丙酮乙醇直接浸提法(浸提20h)提取不同处理时长的小麦幼苗叶绿素并测定其含量。由图1可知，正常生长的小麦幼苗经渍害处理后其叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈先升高后下降的趋势，且在渍害胁迫处理1d时显著高于对照组并到达最大值，分别比对照组显著增加了7.60%(叶绿素a)、21.85%(叶绿素b)和10.07%(总叶绿素)。但自胁迫处理3d开始处理组的叶绿素含量均持续和显著的低于对照组，叶绿素a含量分别比对照组显著降低了12.95%(3d)、21.97%(5d)和35.44%(7d)。与叶绿素a相比，叶绿素b对渍害胁迫更为敏感，在渍害处理后期的下降幅度较大，分别比对照组降低了8.20%(3d)、33.85%(5d)和44.31%(7d)。这使得渍害胁迫下幼苗总叶绿素含量分别较对照组显著降低了12.25%(3d)、24.03%(5d)和36.97%(7d)。

2.2 渍害胁迫对小麦幼苗可溶性糖和淀粉含量的影响

图2 不同渍害胁迫持续时间下小麦幼苗的可溶性糖和淀粉含量Fig.2 The soluble sugar and starch content of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

图3 不同渍害胁迫持续时间下的小麦幼苗TaSUT1基因表达水平Fig.3 Expression levels of TaSUT1 gene of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

糖和淀粉是光合作用的主要终产物，在植物糖代谢中具有特殊的位置[21]。因此，研究对不同渍害胁迫持续时间的小麦幼苗的可溶性糖和淀粉含量进行了分析。结果(见图2)显示,与对照组相比，可溶性糖和淀粉含量均呈现“升高-降低”的趋势，且在渍害胁迫处理1d时，二者的含量均显著高于对照组，分别是对照组的1.06倍(可溶性糖)和1.20倍(淀粉)。但随着渍害胁迫时间的持续，可溶性糖和淀粉含量自胁迫处理3d开始均显著低于对照组，其中，可溶性糖含量分别较对照组降低了12.67%(3d)、22.57%(5d)和35.22%(7d)，淀粉含量则分别较对照组降低了31.20%(3d)、44.67%(5d)和59.84%(7d)。

2.3 渍害胁迫对小麦幼苗中TaSUT1基因表达模式的分析

采用荧光定量PCR技术检测TaSUT1基因的表达水平。结果(见图3)表明，在渍害胁迫1d时，TaSUT1基因的表达水平与对照组无显著差异。但随着胁迫时间的持续，与对照组相比，渍害胁迫显著降低了TaSUT1基因的表达水平，分别比对照组降低了34.98%(3d)、56.49%(5d)和58.51%(7d)。

3 讨论

小麦是一种重要的粮食作物，但是各种环境胁迫(如生物胁迫和非生物胁迫)往往对小麦生长发育造成巨大的影响，使小麦产量和品质大幅度降低[3,22]。因此，研究小麦抗性机制，提高其耐受性，能够显著提高小麦的产量和品质[22]。逆境胁迫对小麦光合元件有多种形式的影响，尤其是对光合作用的影响极为显著[3,22]。叶绿素是植物体内叶绿体的重要组成成分，是植物光合作用中吸收光的主要色素，能将捕捉到的光能转化为生物能，为植物生长发育提供所需的营养物质和能量[3,18]。幼苗期的小麦处于营养生长的初期，需要通过叶片的光合作用为其快速生长提供充足的营养物质。研究表明在盐分和干旱交叉胁迫下，小麦幼苗叶绿素含量呈现先升高后降低的趋势，并随着胁迫程度的加重其含量下降加速[23]。张朝明[22]研究认为在高温和高光共同作用下，小麦叶绿素含量呈显著降低的趋势。程贯召[24]则以不同浓度Cu2+对小麦种子幼苗的生理生化特性进行了研究，发现随着Cu2+浓度的升高，小麦幼苗的叶绿素含量降低，从而抑制了小麦幼苗的光合作用，影响了幼苗的进一步生长和发育。该研究中，在渍害胁迫的初期，小麦叶绿素含量呈现短暂升高的趋势，这表明小麦幼苗在遭受渍害胁迫时表现出一定的适应性，通过提高叶绿素的含量来增强其自身的光合效率，从而提高其抗逆性。但随着渍害胁迫时间的持续，小麦光合色素的合成遭到破坏，表现为叶绿素含量呈现较大的降幅，进而影响幼苗期小麦的光合作用，减缓或抑制植株的正常生长。

淀粉和蔗糖是幼苗期小麦光合作用的主要终产物，也是碳水化合物运输和贮藏的主要形式[21]。叶片光合作用所合成的糖分，可以通过蔗糖转运蛋白将蔗糖分子进行跨膜转运[14]。研究表明，蔗糖转运蛋白参与蔗糖在韧皮部的装载和长距离运输，并在库器官卸载的过程中发挥重要作用[16]。此外，在小麦植株的碳代谢中，蔗糖代谢和淀粉合成既相互依存，又相互制约，是一个不可分割的整体[25]。在该研究中，渍害胁迫对幼苗期小麦糖代谢造成了一定的影响，胁迫初期由于光合作用效率的增强，从而促进了蔗糖的生物合成，加之参与蔗糖长距离运输的TaSUT1基因的表达水平并未显著提高，导致大量蔗糖在叶片内积累，并开始转化为淀粉进行储存，使得幼苗叶片内可溶性糖含量和淀粉含量均显著升高。但随着胁迫时间的持续，叶片光合作用受到显著抑制，导致碳同化过程受阻，叶片中可溶性糖和淀粉含量均急剧降低，TaSUT1基因的表达水平也显著降低，进而使得处于营养生长初期阶段的小麦幼苗因营养物质的缺失而处于畸形的发育状态甚至死亡。