游启孙

(福建三明林业学校，福建 三明 365001)

1 引言

风柜斗草又名楮头红、东方肉穗草，属于野牡丹科肉穗草属草本植物。多生长于密林下荫湿的地方或溪边，是闽南地区常用的民间草药，1989年被厦门市列入濒危植物[1]。全草可入药，具清肝明目的作用，治耳鸣及目雾等症或祛肝火，尤其对急性肝炎疗效最佳，对慢性肝炎及乙肝病毒携带者有效[2], 并用于治疗肝硬化顽固性腹水及原发性肝癌[3],其功能和作用加速了风柜斗草的药理、药效和繁殖等方面的深入研究。但是由于野生资源过度采挖，生态环境的破坏，野生资源日益枯竭，而当前风柜斗草人工繁育主要以采集野生苗分株和扦插，成活率低且繁殖速度慢[4]，并不能满足日益增长的市场需求，因此风柜斗草的组培快繁研究极具意义，既丰富了繁殖方式，又满足了种苗供应。风柜斗草及相近植物相关研究有些许报道，但组培研究报道较少：李金雨等[1]对风柜草栽培技术及开发利用进行相关研究；陈向东[5]介绍林下人工种植风柜斗草的相关技术，详细分析林下种植所带来的市场、经济、生态等效益；蔡坤秀等[6]应用正交试验方法研究野牡丹科叶底红组织培养和快速繁殖条件的优化。目前风柜斗草研究多为栽植技术和药理方向，其组培快繁技术研究鲜有报道，本研究以风柜斗草当年生茎段为材料，建立风柜斗草组培快繁体系，为工厂化育苗提高技术支撑。

2 材料与方法

2.1 试验材料

采集野外风柜斗草并移栽于福建三明林业学校温室大棚，取当年生茎段作为外植体材料。

2.2 试验方法

2.2.1 外植体预处理与消毒

茎杆浸泡于含吐温20的溶液中并清洗，流水冲洗0.5 h。75%酒精处理8～15 s，0.1%HgCl2溶液浸泡6、8、10、12、14 min，无菌水冲洗5次，切为单节茎段，接种于MS培养基中。每处理30瓶，重复3次，每瓶1根，每7 d观察1次，30 d后统计污染率、褐化率与成活率。

2.2.2 芽诱导培养

消毒处理的单节茎段在附加6-BA(1.0、2.0与3.0)mg/L和NAA(0.1与0.5) mg/L激素配比的MS培养基中诱导，以空白MS培养基作为对照，每处理15瓶，重复3次，每瓶接种3根外植体。30 d后统计诱导率和生长情况。

2.2.3 增殖培养

将诱导不定芽转入附加6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和 NAA(0、0.1、0.3 mg/L)的MS培养基作双因素完全试验，以MS基本培养基作为对照，每处理15瓶，重复3次，每瓶接种3丛(3株/丛)。30 d后统计增殖系数和生长状况。

2.2.4 生根培养

以MS、1/2MS、1/3MS培养基 ，IBA(0.1、0.2、0.3 mg/L)及 NAA (0、0.1、0.2 mg/L)作3因素L9(33)正交试验，每处理20瓶，每瓶接种4株，重复3次，30d后统计生根率及根系生长。

2.2.5 炼苗及移栽

在带遮阳网的温室大棚中炼苗7 d，取苗洗净培养基，在0.2%多菌灵溶液中浸根3～5 min，温室大棚进行移栽。移栽基质为消毒过的不同配比营养土、珍珠岩和黄泥土。温度25 ℃左右，喷雾保湿，60 d后统计成活率及生长状况。

以上培养过程中培养基含白砂糖30 g/L，卡拉胶7 g/L，pH值6.0,生根培养添加活性炭0.1%。培养温度(25±1) ℃，光照时间11 h/d，光照强度2000 lx。

2.3 统计分析

应用 Excel软件和DPS v7.05进行统计分析。

3 实验结果

3.1 消毒时间对外植体的影响

不同0.1%HgCl2消毒时间对风柜斗草茎段的影响结果见表1。每处理30瓶，重复3次，共90个外植体，试验结果显示：消毒时间6～14 min，外植体污染率从58.89%下降到2.22%，污染率逐渐降低；褐化率由13.33%增加到74.44%，褐化率不断升高；消毒时间短，褐化率低但是污染率高，外植体消毒时间长，污染率低但是褐化率高，外植体成活率均较低(27.78%和23.33%)；外植体成活率随消毒时间先提升后下降，在10min时成活率最高为65.56%。因此风柜斗草茎段俑0.1%HgCl2消毒最佳时间为10 min。

表1 消毒时间对外植体的影响

3.2 不定芽诱导

6-BA和NAA配比的双因素完全试验对风柜斗草茎段诱导及生长情况影响见表2。对照组诱导率为52.75%，显著低于添加激素的组合，且全部为单芽，表明激素的添加对腋芽的诱导有显著影响；6-BA浓度1～3 mg/L范围内，腋芽诱导率随浓度升高而提升，且多芽率也逐渐提高，当6-BA浓度为3 mg/L时均为多芽，但存在32%玻璃化苗，说明6-BA浓度过高；添加NAA对腋芽诱导有促进作用，浓度为0.1 mg/L相较于0.5 mg/L，诱导率和多芽率都更高，且浓度为0.5 mg/L时会出现无效愈伤，不利于诱导。试验结果显示处理3:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA为最佳诱导配方，诱导率为86.46%，且87%为多芽(图1a)。

表2 6-BA和NAA对外植体诱导的影响

3.3 不同激素配比对对风柜斗草增殖的影响

将诱导的不定芽接种到增殖培养基中做双因素(6-BA，NAA)3水平完全试验，9种组合处理的duncan多重比较结果表明(表3)：在对照未加激素的培养基，芽苗正常生长，但增殖系数为1.37；6-BA各浓度间增殖系数差异性显著，浓度1.5 mg/L对丛生芽增殖影响最大，浓度2.0 mg/L和浓度1.0 mg/L次之，浓度为2.0 mg/L时出现畸形芽；NAA各浓度间差异性同样显著，浓度越高对增殖影响越小且芽苗质量较差，浓度为0.3 mg/L有愈伤出现；处理4的增殖系数最大为6.32，极显著高于其他处理，且芽苗生长好、叶色正常(图1b)。因此最佳增殖培养基为4号处理：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表3 不同激素配比对风柜斗草增殖的影响

3.4 生根诱导培养

取2 cm以上、生长正常的不定芽，采用3因素3水平L9正交试验设计进行生根培养(第四列为空列)。9种组合的根数量与根长度方差分析表明，6-BA和NAA对风柜斗草生根数量和根长度影响极显著，基本培养基对生根影响不显著。duncan多重比较结果显示(表4)：各处理的生根率都在100%，风柜斗草生根较容易；基本培养基(MS、1/2 MS、1/3 MS)对根数量及根长度影响不显著，说明基本培养基对风柜斗草根的生长影响不大；浓度0.2 mg/L的IBA对根数量和根长度影响最大，与其他浓度差异性显著，在根数量上，浓度0.3 mg/L影响次之、浓度0.1 mg/L影响最低，浓度0.3 mg/L和浓度0.1 mg/L对根长度影响不显著；NAA各浓度对根数量和影响差异性显著，影响程度0.1 mg/L>0.2 mg/L>0.0 mg/L，NAA各浓度在根长度影响上，浓度0.1 mg/L与其他浓度差异显著，另外两个浓度差异不显著；IBA少量和NAA不添加时根生长纤细，NAA和IBA浓度高时易产生愈伤。处理2对根数量和长度影响显著的高于其他处理，且根生长较好(粗且无愈伤，图1c)。因此最佳生根培养基为2号处理：MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

表4 基本培养基、6-BA和NAA对风柜斗草试管苗生根的影响

3.5 试管苗炼苗与移栽

生根培养30 d后，将试管苗在温室大棚进行炼苗7 d，前4 d紧闭瓶盖，后3 d逐渐松盖，洗净培养基，0.1%多菌灵浸泡3～5 min，移栽到准备好的基质中，进行移栽试验和duncan多重比较。从表5中看出，基质对移栽成活率有显著差异，4号基质组合移栽成活率最高，极显著高于其他基质组合，黄泥土越高的基质移栽成活率最低且叶色偏黄，营养土中添加少量黄泥土有助于提高移栽成活率，因此风柜斗草最佳移栽基质为营养土∶黄泥土∶珍珠岩(3∶1∶1)，移栽成活率为90.89%，植株长势好、叶色正常(图1f)。

表5 不同基质对风柜斗草试管苗移栽的影响

图1 风柜斗草茎段组培各阶段

4 讨论

植物组培技术能有效的解决药用植物资源短缺的问题[7]。风柜斗草作为福建闽南地区常用药用植物，利用组培手段进行繁殖可以极大的缓和市场的需求。本研究以MS为基本培养基适合各阶段试验，MS、1/2 MS、1/3 MS用于生根试验差异性不显著，与前人研究表明野牡丹科植物适用于MS培养基一致[6]。

6-BA在不定芽诱导和增殖中起重要作用不同培养阶段浓度不同，本研究诱导阶段最适合浓度为2 mg/L,高于这个浓度时产生玻璃化，与高浓度细胞分裂素会增加黄花倒水莲玻璃化苗一致[8]，同时附加少量NAA能有效提高诱导率。在增殖阶段6-BA最适浓度为1.5 mg/L，浓度越高增殖系数反而降低，且易产生畸形芽，与樟树茎段丛生芽增殖试验结论一致[9].分裂素与生长素配比协调能提高丛生芽增殖系数，并提高芽苗质量[10]，本研究中1.5 mg/L 6-BA与0.1 mg/L NAA配比处理的丛生芽增殖系数极显著的高于未添加NAA处理，且芽苗生长良好；NAA浓度提高时，增殖系数和不定芽质量均下降。

风柜斗草与同科其他植物一样易生根，但在添加生长素处理中，根的数量、长度和质量有明显的提高，本研究各处理生根率都在100%,添加0.2 mg/L IBA与0.1 mg/L NAA激素培养基中根的数量、长度和根质量都显著高于其他处理，但浓度过高将影响根的生长、产生愈伤和降低根的质量，这与大丽花组培苗快繁生根试验结论一致[11]。不同移栽基质对风柜斗草移栽成活率和植株生长有显著影响。研究表明营养土中添加适当比例的黄泥土有助于植株生长，本研究得出最适宜基质为营养土∶黄泥土∶珍珠岩(3∶1∶1)，移栽成活率最高，植株长势好。但过高比例影响植株生长，这与黄泥土的透气性差、易板结等性质有关，与黄花倒水莲移栽试验结论一致[8]。

因此以茎段为外植体，通过诱导获得无菌苗、不定芽增殖、生根和炼苗移栽等阶段建立风柜斗草组培快繁体系，为实现工厂化育苗提供技术保障。