杨谷良+邓先珍+范媛媛

摘要：以宝华甜柿（Diospyros kaki c.v.‘Baohuatianshi）为材料，在对试验材料进行热激处理后，检测了活性氧代谢相关生理指标的变化情况。结果表明，经过热激处理后，与对照相比，外植体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力出现了提高，丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的含量则有所降低。说明热激处理能够降低活性氧含量，保护了细胞膜结构的完整性，抑制了褐变发生。

关键词：甜柿（Diospyros kaki Thunb）；组织培养；热激处理；活性氧；保护酶

中图分类号：S665.2；Q945.79 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4619-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.029

Effects of Heat Shock on Active Oxygen Metabolism

of Diospyros kaki Thunb Explants

YANG Gu-liang1，2， DENG Xian-zhen1，3， FAN Yuan-yuan1，2

（1. Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization， Huanggang 438000， Hubei， China； 2. College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China；

3. Hubei Academy of Forestry Sciences， Wuhan 430075， China）

Abstract： The leaf of “Baohuatianshi” was treated under 45 ℃ for 30 min and the parameters of active oxygen metabolism-related physiological indeexes were investigated. Results showed that compared with the control， the activity of superoxide dismutase（SOD） and scavenger enzymes（CAT） could be improved in a short period after the heat shock treatment， and then the content of malondialdehyde（MDA） and hydrogen （H2O2） reduced. It is indicated that the content of active oxygen was reduced by the heat shock treatment， thus the cell membranes stability was protected and the heat shock treatment could effectively suppress tissue culture browning in persimmon.

Key words： Diospyros kaki Thunb； tissue culture； heat shock treatment； reactive oxygen species； protective enzyme

柿（Diospyros kaki L.f）是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros）一种广泛栽培的果树。中国已有2 000多年柿树种植历史，是世界上柿树栽培最早的国家[1]。宝华甜柿（Diospyros kaki c.v.‘Baohuatianshi）是湖北省罗田县的一个地方品种，于2001年通过了湖北省林木良种审定委员会审定，是我国选育成功的第一个完全甜柿新品种，宝华甜柿不经过脱涩处理就可以食用，果品贮藏时间比涩柿长，具有广阔的发展前景[2]。

甜柿组织培养过程中容易出现褐化，据张妙霞等[3]报道，在甜柿组织培养的过程中，褐变率最高达到90%，严重影响了组织培养的增殖率和成活率。多数学者认为，对植物适度热激处理可以降低总酚含量，从而减轻组织褐变的程度[4，5]。为此以罗田地方品种宝华甜柿叶片为试验材料，接种在培养基MS（1/2N）+ 2.0 mg/L ZT（玉米素） + 0.1 mg/L TDZ（噻苯隆）进行培养，通过比较对照组与热激处理组叶片外植体组织培养褐变程度，分析了热激处理对酚类物质代谢的影响，初步揭示了热激处理抑制甜柿组织培养褐变的生理机制，以期为热激处理应用于生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

选取无菌条件下培养的没有褐变的宝华甜柿为试验材料，在45 ℃条件下，将带有叶片的植株热激处理30 min后，正常条件下培养24 h[（培养温度25 ℃，光照度40 μmol/（m2·s）]，然后选取成熟度基本一致的叶片剪成1.0 cm2大小的外植体，每瓶内接种3个外植体，外植体培养的培养基组成为：MS（1/2 N）+2.0 mg /L ZT + 0.1 mg/L TDZ。同时，以没有经过热激处理的叶片作为外植体接种在相同的培养基组成上作为对照。对照与处理各接种50 瓶，均放入智能光照培养箱中培养，培养温度25 ℃，光照度40 μmol/（m2·s），每天光照时间12 h。在接种后第0、6、12、18、24天，每次各随机取出4瓶用于生理指标测定，每个指标3次重复。

1.2 测定方法

参照Heath等[6]的方法测定丙二醛（MDA）的含量，参照Yang等[7]的方法测定过氧化氢（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。

2 结果与分析

2.1 热激处理对宝华甜柿外植体MDA含量的影响

从图1可以看出，在培养的前6 d，处理组和对照MDA含量差异不明显。从第6天开始，处理组的MDA 含量与对照有较大差异，其中第18天时二者差异最大，差异达到8.03 nmol/g，比对照低66.9%。MDA是膜脂过氧化产物之一，MDA含量越高，植株受到的伤害就越严重。热激处理后MDA含量降低，表明在培养过程中，热激处理保护了外植体细胞膜的完整性。

2.2 热激处理对宝华甜柿外植体H2O2含量的影响

图2显示的是热激处理后宝华甜柿外植体中H2O2含量的变化情况。从图2中可以看出，处理组和对照H2O2含量的变化趋势与MDA基本一致，也是在6 d时差距不明显，6 d以后，对照H2O2含量明显高于处理组。其中培养到第18天时，处理组的外植体中H2O2含量比对照组降低了30%。

2.3 热激处理对宝华甜柿外植体SOD活性的影响

对比对照组与处理组宝华甜柿叶片外植体的SOD 活性变化趋势，两者均在第6天后开始有比较明显的下降（图3），从第12天以后维持在一个相对较低的水平。与对照相比，处理组的SOD活性在第6天高于对照，第12、18、24天分别比对照低50%、56.3%、50%。

2.4 热激处理对宝华甜柿外植体CAT活性的影响

CAT能清除植株内产生的H2O2，从而使H2O2控制在较低水平。在整个检测过程中，对照与热激处理组的CAT活性变化趋势基本一致，在第6～18天均有明显增加，以后维持在一个稳定水平（图4）。

2.5 相关分析

从表1可以看出，H2O2与MDA、SOD、CAT的相关系数分别为0.915 1、-0.909 6、0.976 8，与MDA和CAT呈正相关，而与SOD呈负相关性。

3 小结与讨论

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，其含量高低是膜脂过氧化损伤程度的标志[8]，在整个试验阶段，MDA含量与H2O2含量表现出一致性。随着处理时间的延长，对照的外植体内MDA不断积累，而处理组的外植体内MDA含量一直维持在一个比较恒定的范围内。这可能是由于在进行外植体的切割操作时，对外植体的细胞膜造成一定的伤害，导致对照组外植体内MDA含量的上升。而热激处理后，可能由于“交叉适应”反应，细胞具有更强的适应机械损伤的能力，从而减轻了胁迫对外植体造成的伤害[9]。

经过热激处理后，外植体的抗氧化酶活性有所提高，这些酶具有维护细胞膜稳定性的作用。SOD可以在短时间内清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，进而减轻细胞膜损伤程度，减少酚氧化酶（PPO）与酚类底物氧化接触的机会，最终有效抑制宝华甜柿叶片外植体酶促褐变的发生。

参考文献：

[1] 罗正荣，蔡礼鸿，胡春根.柿属植物种质资源及其利用现状[J]. 华中农业大学学报，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.宝华甜柿品种特性及栽培技术要点[J].西南园艺，2004，32（2）：68-70.

[3] 张妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究[J].河南农业大学学报，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韬.海南粗榧愈伤组织增殖及抗褐变研究[D].海口：海南大学，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，罗云波.运输中的机械损伤对贮藏初期苹果活性氧代谢的影响[J].中国农业大学学报，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.

1.2 测定方法

参照Heath等[6]的方法测定丙二醛（MDA）的含量，参照Yang等[7]的方法测定过氧化氢（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。

2 结果与分析

2.1 热激处理对宝华甜柿外植体MDA含量的影响

从图1可以看出，在培养的前6 d，处理组和对照MDA含量差异不明显。从第6天开始，处理组的MDA 含量与对照有较大差异，其中第18天时二者差异最大，差异达到8.03 nmol/g，比对照低66.9%。MDA是膜脂过氧化产物之一，MDA含量越高，植株受到的伤害就越严重。热激处理后MDA含量降低，表明在培养过程中，热激处理保护了外植体细胞膜的完整性。

2.2 热激处理对宝华甜柿外植体H2O2含量的影响

图2显示的是热激处理后宝华甜柿外植体中H2O2含量的变化情况。从图2中可以看出，处理组和对照H2O2含量的变化趋势与MDA基本一致，也是在6 d时差距不明显，6 d以后，对照H2O2含量明显高于处理组。其中培养到第18天时，处理组的外植体中H2O2含量比对照组降低了30%。

2.3 热激处理对宝华甜柿外植体SOD活性的影响

对比对照组与处理组宝华甜柿叶片外植体的SOD 活性变化趋势，两者均在第6天后开始有比较明显的下降（图3），从第12天以后维持在一个相对较低的水平。与对照相比，处理组的SOD活性在第6天高于对照，第12、18、24天分别比对照低50%、56.3%、50%。

2.4 热激处理对宝华甜柿外植体CAT活性的影响

CAT能清除植株内产生的H2O2，从而使H2O2控制在较低水平。在整个检测过程中，对照与热激处理组的CAT活性变化趋势基本一致，在第6～18天均有明显增加，以后维持在一个稳定水平（图4）。

2.5 相关分析

从表1可以看出，H2O2与MDA、SOD、CAT的相关系数分别为0.915 1、-0.909 6、0.976 8，与MDA和CAT呈正相关，而与SOD呈负相关性。

3 小结与讨论

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，其含量高低是膜脂过氧化损伤程度的标志[8]，在整个试验阶段，MDA含量与H2O2含量表现出一致性。随着处理时间的延长，对照的外植体内MDA不断积累，而处理组的外植体内MDA含量一直维持在一个比较恒定的范围内。这可能是由于在进行外植体的切割操作时，对外植体的细胞膜造成一定的伤害，导致对照组外植体内MDA含量的上升。而热激处理后，可能由于“交叉适应”反应，细胞具有更强的适应机械损伤的能力，从而减轻了胁迫对外植体造成的伤害[9]。

经过热激处理后，外植体的抗氧化酶活性有所提高，这些酶具有维护细胞膜稳定性的作用。SOD可以在短时间内清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，进而减轻细胞膜损伤程度，减少酚氧化酶（PPO）与酚类底物氧化接触的机会，最终有效抑制宝华甜柿叶片外植体酶促褐变的发生。

参考文献：

[1] 罗正荣，蔡礼鸿，胡春根.柿属植物种质资源及其利用现状[J]. 华中农业大学学报，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.宝华甜柿品种特性及栽培技术要点[J].西南园艺，2004，32（2）：68-70.

[3] 张妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究[J].河南农业大学学报，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韬.海南粗榧愈伤组织增殖及抗褐变研究[D].海口：海南大学，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，罗云波.运输中的机械损伤对贮藏初期苹果活性氧代谢的影响[J].中国农业大学学报，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.

1.2 测定方法

参照Heath等[6]的方法测定丙二醛（MDA）的含量，参照Yang等[7]的方法测定过氧化氢（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。

2 结果与分析

2.1 热激处理对宝华甜柿外植体MDA含量的影响

从图1可以看出，在培养的前6 d，处理组和对照MDA含量差异不明显。从第6天开始，处理组的MDA 含量与对照有较大差异，其中第18天时二者差异最大，差异达到8.03 nmol/g，比对照低66.9%。MDA是膜脂过氧化产物之一，MDA含量越高，植株受到的伤害就越严重。热激处理后MDA含量降低，表明在培养过程中，热激处理保护了外植体细胞膜的完整性。

2.2 热激处理对宝华甜柿外植体H2O2含量的影响

图2显示的是热激处理后宝华甜柿外植体中H2O2含量的变化情况。从图2中可以看出，处理组和对照H2O2含量的变化趋势与MDA基本一致，也是在6 d时差距不明显，6 d以后，对照H2O2含量明显高于处理组。其中培养到第18天时，处理组的外植体中H2O2含量比对照组降低了30%。

2.3 热激处理对宝华甜柿外植体SOD活性的影响

对比对照组与处理组宝华甜柿叶片外植体的SOD 活性变化趋势，两者均在第6天后开始有比较明显的下降（图3），从第12天以后维持在一个相对较低的水平。与对照相比，处理组的SOD活性在第6天高于对照，第12、18、24天分别比对照低50%、56.3%、50%。

2.4 热激处理对宝华甜柿外植体CAT活性的影响

CAT能清除植株内产生的H2O2，从而使H2O2控制在较低水平。在整个检测过程中，对照与热激处理组的CAT活性变化趋势基本一致，在第6～18天均有明显增加，以后维持在一个稳定水平（图4）。

2.5 相关分析

从表1可以看出，H2O2与MDA、SOD、CAT的相关系数分别为0.915 1、-0.909 6、0.976 8，与MDA和CAT呈正相关，而与SOD呈负相关性。

3 小结与讨论

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，其含量高低是膜脂过氧化损伤程度的标志[8]，在整个试验阶段，MDA含量与H2O2含量表现出一致性。随着处理时间的延长，对照的外植体内MDA不断积累，而处理组的外植体内MDA含量一直维持在一个比较恒定的范围内。这可能是由于在进行外植体的切割操作时，对外植体的细胞膜造成一定的伤害，导致对照组外植体内MDA含量的上升。而热激处理后，可能由于“交叉适应”反应，细胞具有更强的适应机械损伤的能力，从而减轻了胁迫对外植体造成的伤害[9]。

经过热激处理后，外植体的抗氧化酶活性有所提高，这些酶具有维护细胞膜稳定性的作用。SOD可以在短时间内清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，进而减轻细胞膜损伤程度，减少酚氧化酶（PPO）与酚类底物氧化接触的机会，最终有效抑制宝华甜柿叶片外植体酶促褐变的发生。

参考文献：

[1] 罗正荣，蔡礼鸿，胡春根.柿属植物种质资源及其利用现状[J]. 华中农业大学学报，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.宝华甜柿品种特性及栽培技术要点[J].西南园艺，2004，32（2）：68-70.

[3] 张妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究[J].河南农业大学学报，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韬.海南粗榧愈伤组织增殖及抗褐变研究[D].海口：海南大学，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，罗云波.运输中的机械损伤对贮藏初期苹果活性氧代谢的影响[J].中国农业大学学报，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.