杨明，范小琴，鄢敏，韩灵，郑朝攀

(1.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院 耳鼻咽喉科，广东 深圳 518020； 2.深圳市纳米酶肿瘤转化医学重点实验室 深圳市转化医学研究院 深圳市第二人民医院/深圳大学第一附属医院 耳鼻咽喉科，广东 深圳 518035)

肿瘤微环境 (tumor microenviroment, TME) 在恶性肿瘤发生发展中具有重要的调控作用，肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts, CAFs)作为TME中数量最丰富的一类细胞，是TME的重要组成成分，并通过与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤发生发展和转移，成为近年靶向TME治疗的研究热点[1-3]。在TME中CAFs通过分泌多种细胞因子(cytokine)、趋化因子(chemokine)和炎性因子(inflammatory cytokines) 等激活肿瘤细胞内多条信号通路，从而促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和血管生成[4-5]。然而，大量研究显示在TME中不同肿瘤类型或不同肿瘤来源的CAFs细胞存在高度的异质性，导致CAFs的类型和生物学作用存在很大差异[6]。因此分离、培养和鉴定不同类型TME中的CAFs成为目前TME研究的前沿问题[7]。目前，针对TME中CAFs的研究较少[8]。本研究通过鼻咽癌和鼻咽炎新鲜组织3D 培养的新方法，分离、培养和鉴定CAFs，为研究CAFs在鼻咽癌发生发展和转移中生物学作用等基础研究提供了前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂耗材 I型胶原酶(Sigma 公司 #SCR103)，胰蛋白酶(Sigma 公司 #T1426)，PBS(Hyclone 公司 #SH30256)，胎牛血清(Sigma 公司 #F8687)，DMEM (Gibco 公司#C11995065)，RPMI-1640 (Gibco 公司 #C11875500BT), CAFs标志物检测试剂盒 (CST公司 #31549)， ECL化学发光试剂盒(Protein technology 公司 #PK10002)，Matrigel (Corning公司 #356234)，青链霉素 (Hyclone公司 #SV30010)，BCA蛋白定量试剂盒 (Protein technology公司 #23225)，RIPA细胞裂解液 (碧云天公司 # P0013B)，DMSO (Sigma公司 #D8779)，蛋白酶抑制剂(Roche公司# 4693116001)，磷酸酶抑制剂(Roche 公司 # 4906837001)。

1.1.2 组织样本 收集深圳市人民医院2020年1—6月临床病理鉴定的新鲜鼻咽癌组织和鼻咽炎组织各3例。……