鸡胸肌冻干粉赖氨酸近红外定量预测模型的建立与优化

2021-11-05陶琳丽陶冶甘文斌杜光英李富银王天武尹汝高凡杨万进张曦牛国一

现代食品科技 2021年10期

陶琳丽，陶冶，甘文斌，杜光英，李富银，王天武，尹汝高凡，杨万进，张曦*，牛国一*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201）（2.云南省饲料工业协会，云南昆明 650201）（3.云南省兽药饲料检测所，云南昆明 650201)

鸡肉作为人类健康经济的蛋白质来源，一直深受消费者的喜爱，占具着重要的肉品市场份额。赖氨酸是鸡肉蛋白质的重要组成部分，是人的第一限制性氨基酸、鸡的第二限制性氨基酸。因此，检测鸡肉中赖氨酸含量对鸡肉加工利用，鸡育种、养殖技术提升都具有重要意义。

赖氨酸含量检测方法有分光光度法、气相色谱法、高相液相色谱法、液相色谱与质谱联用法、毛细管电泳法等[1]。目前，鸡肉赖氨酸含量的检测主要使用高相液相色谱法，如柱后衍生氨基酸分析仪法[2]、柱前衍生液相色谱法[3]。这两种方法在进行赖氨酸分析时均需进行复杂的样品前处理，存在耗时长、试剂种类多、操作复杂、仪器精度要求高、检测成本高等问题，制约大批量鸡肉样本氨基酸的检测。近红外光谱定量分析技术是近年来发展迅速的一种绿色安全简便的检测技术，已被广泛的应用于各种有机物的检测。在氨基酸检测中，近红外定量预测模型已被用于水果[4]、饲料[5]、中药[6]等。对于肉类检测，已有关于羊肉中氨基酸近红外光谱建模方面的报道，但近红外在鸡肉化学成分检测上的应用研究仅见于粗蛋白质、粗脂肪、脂肪酸、水分等[7]指标，鲜见氨基酸方面的报导。不同种类来源的相同化学成分，近红外定量预测模型不能通用，因此鸡肉中赖氨酸定量预测模型的建立对鸡肉产业的发展具有十分重要的意义。

一个实用的近红外定量校正模型应具有预测结果相关性高，标准偏差低，但相关性又不能是由过拟合造成等特点。在建模过程中，一般通过四个方面来提高模型的精度与稳定性：一是通过光谱预处理方法减少以至消除各种非目标因素对光谱的影响，提高光谱的有效信息量[8]；二是通过特征光谱的选取，提高模型的预测精度[9]；三是删除降低模型预测精度异常样本[10]；四是合理进行建模校正集和外部验证集的选择[11]。因此，本文以五种不同来源的云南地方鸡胸肌冻干粉中的赖氨酸为研究对象，研究不同建模因素对鸡胸肌赖氨酸近红外定量校正模型建模的影响，以期获得最佳的鸡胸肌赖氨酸近红外定量校正模型，为今后鸡肉中赖氨酸的定量检测提供一种快捷准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集300～350日龄、放养的云南省香格里拉县尼西鸡48羽（NX，公22，母26）、剑川县青花鸡58羽（QH，公28，母30）、南涧县无量山乌骨鸡52羽（LW，公26，母26）、新平县黎明鸡58羽（XP，公30，母28），武定县武定鸡47羽（WD，公18，母29），5种鸡的胸肌，制成冻干粉，作为研究样本，各品种样本记为NXX、QHX、LWX、XPX、WDX。

1.2 赖氨酸含量的化学检测方法

采用高效液相色谱内标法进行检测（岛津高效液相色谱仪LC-20A），赖氨酸检测方法参照天津市博纳艾杰尔科技有限公司Venusil AA氨基酸分析方法[12]进行。

1.3 近红外光谱采集

将样品装入0.6 mm厚聚乙烯自封袋[13]，样品厚度5 mm。使用岛津傅立叶变换红外光谱仪IRPrestige-21（配套近红外附件FlexIRTM Near-Infrared Fiber Optics module）扫描样品，光谱采集软件岛津IRsolution 1.50。样品扫描前先将0.6 mm聚乙烯圆片置于背景金箔面上进行背景去除，去除PE自封袋的影响。光谱扫描的波长范围为1000～2502 nm，分辨率8 cm-1，每个样品扫描3次，每次扫描50遍，以3条近红外光谱的平均值作为样品原始光谱。

1.4 光谱预处理方法筛选

由于样品不同成分之间的相互干扰，导致近红外光谱谱带重叠，存在谱峰掩盖及信号噪声等问题，一般会在获得样品近红外漫反射光谱（Near Infrared Reflection Spectroscopy，NIRS）后进行光谱预处理，即消除光谱噪声和其它谱图不规则因素的影响[8]。本文采用标准正态变量变换（SNV）、多元散射校正（MSC），一阶导数[gapsegment(1#,15,7)]、二阶导数[gapsegment(2#,15,7)]、标准正态变换结合一阶导数法[SNV+gapsegment(1#,15,7)]、标准正态变换结合二阶导数法[SNV+gapsegment(2#,15,7)]、标准正态变换结合去趋势算法（SNV+Detrending）等7种光谱预处理方法对鸡肉NIRS进行光谱预处理。具体过程如下：

（1）将263个样本划分为校正集200样本（每种地方鸡取40个样本（除WDX公鸡18个，母鸡22个外，其余四种鸡公母各半）和外部验证集63样本，样本划分时满足验证样品的赖氨酸检测值均包含在校正样品中的要求，该样本划分方法称为鸡种样本划分法。

（2）采用7种光谱预处理方法对鸡肉NIRS进行光谱预处理。

（3）使用原始光谱、7种预处理光谱，在全谱段（1000～2502 nm）上采用偏最小二乘法PLS、内部留一交互验证建立校正模型。根据模型的优劣筛选赖氨酸的光谱预处理方法，记为NIRS-preprocess1。

1.5 建模特征光谱筛选

随着对NIR结合PLS建模方法的深入研究和应用发现，通过特定方法筛选特征波长或波长区间有可能得到更好的定量校正模型，波长选择不但可以简化模型，还可以通过剔除不相关或非线性变量，得到预测能力强、稳健性好的校正模型[14]。本文对特征光谱筛选的过程如下：

（1）根据5种鸡胸肌冻干粉光谱形态和主成分分析（PCA）结果将样品NIRS划分成不同谱区。在这些谱区上，采用原始光谱和NIRS-preprocess1光谱进行建模。评价各谱区校正模型的优劣，筛选出建模最佳谱区，记为Feature-spectrum1。

（2）将1000～2502 nm全谱区划分为155个子区间、77个子区间、39个子区间、10个子区间，Feature-spectrum1谱区划分为97个子区间、40个子区间、10个子区间，使用前向间隔偏最小二乘法（Forward Interval PLS，FiPLS）[15]筛选不同子区间上的建模特征谱区，使用PLS建立校正模型。

（3）根据（2）的研究结果，在1000～2502 nm谱区和Feature-spectrum1谱区上筛选出较优的子区间划分方法各2个，再在这4个子区间上使用后向间隔偏最小二乘法（Backward interval PLS，BiPLS）[16]的进行特征光谱区筛选，在筛选出的4个特征光谱区间上使用PLS建立校正模型。

（4）根据（2）的研究结果，在1000～2502 nm谱区和Feature-spectrum1谱区上筛选出最优的建模特征光谱各1个，在FiPLS法筛选的最优特征光谱基础上，再使用BiPLS法进行特征光谱区的筛选，记为FBipls法。在FBipls法筛选的特征光谱区间，使用PLS1建立校正模型。

（5）比较上述不同特征光谱区的建模效果，筛选出最佳的建模光谱区域。

1.6 异常样本的剔除

异常样本是指在建模过程中加入某些样本后导致所建模型的预测精度大幅降低的样本，主要包括2类，一类是由操作误差和设备误差导致，这类样本应视为异常样本进行剔除；另一类是由样本本身属性的不同导致化学值和光谱值与其他样品相比具有特殊性，加入这些样本虽会降低模型对一般样本的预测精度，但可显著提高模型的适配范围[11]。本文采用蒙特卡洛交叉验证法（MCCV）作为异常样本剔除方法，其matlab算法由Michal Daszykowski提供网络下载http://www.chemometria.us.edu.pl。

具体步骤如下：

步骤1：针对所有样本使用PLS确定最佳主成分数；

步骤2：使用蒙特卡洛随机取样法选取80%样本作为校正集，剩余20%作为验证集，根据步骤1所确定的最佳主成分数，针对校正集使用PLS方法建立回归模型，并对验证集进行预测，获得验证集每个样本的预测值；

步骤3：将步骤2循环2000次，得到每个样本的预测误差分布；

步骤4：计算每个样本预测残差的均值（MEAN）和方差（STD），绘制样本的残差均值—方差分布图，根据绘制的均值—方差分布图，确定在一定方差下，不同较大残差下的样本数，将这些样本作为异常样本。

步骤5：对胸肌冻干粉原始光谱按上述四个步骤建立均值—方差分布图，根据残差均值、残差方差和剔除数量划分成2组具有不同数量的异常样本集（异常样本集1、异常样本集2），研究剔除不同异常样本数对模型的影响。

1.7 校正集和验证集样本的选择

校正集和验证集样本的选择方法有常规选择和计算机识别[17]。本文上述研究过程中采用的就是常规选择法，即根据鸡种进行选择。现增加SPXY算法选择校正集和验证集，SPXY算法的优点是能有效覆盖多维向量空间，从而改善模型预测能力。在计算样品间距离时SPXY算法同时将x变量和y变量同时考虑在内[18]，其标准化的xy距离公式为：

式中：

N——样品数；

x——PLS确定的主成分；

y——化学检测值；

dx(p,q)——p和q主成分的欧氏距离；

dy(p,q)——p和q化学检测值的欧氏距离。

在剔除异常样本集的基础上，根据计算的欧氏距离进行样本集和验证集的重新划分。

1.8 综合优化建模研究

以原始光谱PLS的主成分数为依据，采用MCCV方法筛选出2个相同残差方差、不同残差均值的异常样本集，在全样本集、删除异常样本集1和删除异常样本集2的基础上，采用SPXY方法划分校正集和验证集，形成3个新的校正集和验证集，针对1.2.2选定的建模谱段和1.2.1选定的光谱预处理方法，采用PLS方法建立胸肌赖氨酸定量预测模型。评价建模效果，最终筛选出鸡胸肌赖氨酸最佳校正模型。

1.9 数据处理与模型评价

采用校正决定系数R2 CAL、校正标准偏差SECAL、留一法内部交互验证决定系数R2 CV、留一法内部交互验证标准偏差SECV进行评价，以最高的R2 CAL和SECV确定最优校正模型。

式中：

yi,actual——第i个样品化学检测值；

yi,predicted——用所建模型对第i个样品的预测值；

ȳi,actual——建模集中所有样品化学检测值的平均值；

使用外部验证集对校正模型进行外部验证。评价指标是预测决定系数预测标准偏差SEp，验证集标准偏差与预测标准偏差的比值RPDp。和SEp的计算公式同校正集。

根据校正模型的评价指标、内部交互验证的评价指标和外部验证评价指标综合评定模型的优劣。

2 结果与讨论

2.1 胸肌冻干粉赖氨酸化学方法检测结果

根据1.4中的鸡种划分法对263个样本进行划分，划分后的校正集和外部验证集赖氨酸含量化学方法检测结果如表1所示。校正集样本赖氨酸含量在10.07%～6.30%之间，外部验证集样本的赖氨酸含量为9.90%～6.76%，包含在校正集中，满足近红外模型的建模和验证要求。由表1可以看出，无量山乌骨鸡胸肌中赖氨酸含量较高，平均值为9.63%，且变异系数最低CV仅为3.03%；武定鸡胸肌中赖氨酸含量最低，平均值仅为7.32%；青花鸡和新平黎明鸡胸肌中赖氨酸含量变异较大，其CV均大于8%。

表1 胸肌冻干粉赖氨酸含量化学检测结果Table 1 Statistics of lysine content measured by chemical method for the breast muscles freeze-dried powder

2.2 光谱预处理方法筛选

由表2可知，在全谱段1000～2502 nm波长范围内，不同光谱预处理方法对建模结果存在一定影响。SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱的建模结果最佳，而SNV+Detrending光谱所获结果较差，SNV和MSC两种光谱预效果相同。因此，本研究的光谱预处理方法为SNV+gapsegment (1#,15,7)方法。陆艳婷等[19]使用“一阶导数+多元散射校正”和“一阶导数+矢量归一化”两种光谱预处理方法建立的粳稻赖氨酸NIRS预测模型效果较优，其均为0.85。牛智友等[20]使用“变量标准化，7点平滑，二阶导数”光谱预处理方法建立的鱼粉赖氨酸NIRS预测模型的为0.95。上述研究所用光谱预处理方法与本文结论不一致，其原因主要是样本来源不同，样本赖氨酸及其NIRS差异所致。

表2 不同光谱预处理方法建模结果Table 2 The modeling results of different spectra pretreatment methods

2.3 建模特征光谱筛选

2.3.1 原始光谱图和SNV+gapsegment(1#,15,7)光谱图

由图1a可知，五种地方鸡胸肌冻干粉的原始光谱相似，有6个明显的吸收峰，但在2300～2502 nm区间内表示出相对较大的差异，图1b中也表现出此特征。武定鸡在1000～1450 nm谱段的吸光度值相对较高，而在1900～2502 nm谱段武定鸡和新平黎明鸡相对其他3种鸡吸光度值较低。就整条光谱吸光度值变化来看，青花鸡和尼西鸡的吸光度值变化差异最大，武定鸡的吸光度值变化差异最小，推测吸光度值的差异与不同鸡种胸肌冻干粉中粗蛋白质的含量不同有关。研究报导，赖氨酸纯品NIRS吸收峰的谱区为1150～1250 nm、1400～1450 nm、1700～1800 nm、2100～2500 nm，强吸收峰出现在1722 nm和2122 nm，这与赖氨酸主链上存在多个-CH2有关[21]。鸡腿肌冻干粉提取蛋白质的吸收峰与腿肌冻干粉的吸收峰相似，也有6个明显吸收峰[22]，与图1中的6个吸收峰1130～1275 nm、1350～1580 nm、1670～1890 nm、1900～2460 nm位置相同。因胸肌冻干粉中蛋白质含量在80%～93%之间，所以图1中冻干粉NIRS主要受蛋白质NIRS的影响。构成蛋白质的酰氨基团在1500～1530 nm附近为N-H伸缩振动的一级倍频，2050～2060 nm附近为N-H伸缩振动的组合频吸收，2168～2180 nm附近为N-H弯曲的二级倍频与C=O伸缩/N-H面内弯曲/C-N伸缩振动的组合频[23]。α螺旋结构较多的蛋白质在2445 nm、2291～2281 nm、2167 nm和1738 nm区域会出现比较强的谱带，β折叠结构为主的蛋白质则多在2463 nm、2270 nm、2210～2203 nm、2055 nm和1691～1688 nm附近出现[24]。其中，1130～1275 nm处的吸收峰与C-H基团振动二级倍频吸收有关，1350～1580 nm处的吸收峰与2100～2500 nm与C-H基团的组合频相关[22]。牛血清蛋白冻干粉NIRS在1570 nm、1698～1738 nm、2057 nm、2071 nm、2289～2462 nm区域也有5个明显特征吸收峰[25]。综上，图1中1200 nm附近的吸收峰与C-H基团振动的二级倍频有关，1550 nm附近的吸收光谱主要与酰氨基团N-H伸缩振动的一级倍频、C-H基团振动的组合频有关；1700～1800 nm附近的吸收光谱主要与C-H基团振动的一级倍频有关以及蛋白质的二级结构有关；2000～2502 nm处的三个吸收峰与蛋白质的二级结构、NH基团的倍频、羧酸等相关，在2300～2502 nm谱区光谱表现尤其复杂，赖氨酸纯品的特征吸收峰均在此谱区中出现。

图1 胸肌冻干粉近红外光谱图Fig.1 NIRS of the freeze-dried breast muscles powder

对胸肌冻干粉原始光谱进行PCA分析，以2个主成分为坐标建立二维得分图（图2a）。其中PC1对光谱矩阵的累积方差贡献为82%，PC2为14%，因此，样本在二维空间的分布可反应其特征。在图2a中，除武定鸡部分样品散落于得分图的下方，其余4种鸡和一半武定鸡样品混杂为一体，聚类趋势不明显。由于PC1已包含了绝大多数分类信息，因此可根据PC1的载荷图提取近红外的特征光谱[26]。从载荷图2b可以看出，胸肌冻干粉的特征光谱区主要在1100～1250 nm、1350～1550 nm、1650～1800 nm、1900～ 2100 nm、2100～2250 nm、2250～2502 nm六个光谱区间。De la haba等的研究表明混合肉糜及屠宰下脚料中氨基酸的特征谱区为1650～1794 nm和2224～2394 nm[27]。

图2 胸肌冻干粉原始光谱主成分分析Fig.2 PCA analysis of original NIRS of the freeze-dried breast muscles powder

综合图1和图2分析结果，将1000～2502 nm波长区域划分为：1000～1299 nm、1300～1649 nm、1650～1879 nm、1880～2089 nm、2091～2229 nm、2231～2502 nm六个光谱区域，同时又根据原始光谱吸光度的高低，将全谱段划分成1600～2502 nm和1000～1599 nm两个组合区域，研究上述8个光谱区域对胸肌冻干粉赖氨酸NIRS定量模型预测精度的影响。

2.3.2 不同谱区建模效果比较

使用原始光谱和SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱，在上述8个光谱区域使用PLS方法进行建模，建模结果如表3所示。

在表3所建的16个模型中，最优模型是1000～1599 nm谱区，采用原始光谱所建模型，其R2 CAL为0.83，SECV为0.5152，RPDP为1.70，优于表2中的最优模型（1000～2502 nm，SNV+gapsegment(1#,15,7)，R2 CAL=0.83，SECV=0.5198，RPDP=1.52）。表3的次优模型为1000～1299 nm谱区，采用原始光谱所建模型，其R2 CAL为0.80，SECV为0.5399，RPDP为1.62。从表3可以看出，采用原始光谱所建模型均优于采用SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱所建模型。

表3 胸肌冻干粉赖氨酸建模结果Table 3 The modeling results for lysine of freeze-dried breast muscles powder

2.3.3 采用FiPLS、BiPLS、FBiPLS三种方法进行建模特征谱区筛选

在1000～2502 nm和1000～1599 nm上采用FiPLS、BiPLS、FBiPLS三种方法筛选建模最适特征谱区，特征谱区筛选结果如表4所示。其中，使用FiPLS方法获得7个建模谱区，BiPLS获得4个建模谱区，FBiPLS获得2个建模谱区。分别在这13个特征谱区，使用原始光谱和SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱，应用PLS方法建立校正模型。建模结果如表5所示。

表4 FiPLS、BiPLS、FBiPLS优选的建模光谱区域Table 4 The optimum intervals of modeling spectra by FiPLS, BiPLS and FBiPLS

在表5中，最优模型为Lys1558-39和Lys973-97B两个特征谱区使用原始光谱所建，虽然Lys1558-155特征谱区所建模型R2 CAL和SECV结果较好，但其RPDP为1.41，说明模型的稳定性较差，不能作为最优模型。为更全面的研究建模谱区对模型的影响，综合考虑将Lys1558-39、Lys973-40、Lys973-97B、Lys973-40B、Lys1558-39-29B五个光谱区域定为下一步研究的建模光谱区域。

2.4 异常样本的剔除

在图3中，残差方差超过0.017以上有6个样本，其中尼西鸡样本4个，武定鸡样本1个，新平黎明鸡1个。根据残差均值和离散程序，将残差均值的判定线分别定为0.7、0.5，即异常样本集1（残差均值>0.7和方差>0.017）有36个样本，异常样本集2（残差均值>0.5和方差>0.017）有68个样本。

图3 胸肌冻干赖氨酸原始光谱MCCV法残差均值-方差图Fig.3 The residual mean-variance scatter of MCCV based on the spectra of freeze-dried breast muscle powder and lysine values

2.5 综合优化建模结果

表6 显示：没有删除异常样本时，使用SPXY法选择的校正样本和外部验证样本，最优模型为Lys973-97B建模谱区，使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.85、SECV=0.4797、R2 p=0.75、RPDP=1.98。删除异常样本集1时，3个模型结果较优，分别为1000～2502 nm使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.84、SECV=0.4300、R2 p=0.84、RPDP=2.52；Lys973-97B使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.87、SECV=0.4521、R2 p=0.82、RPDP=2.39；1000～1599 nm区域使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.85、SECV=0.4626、R2 p=0.84、RPDP=2.50。删除异常样本集2的建模结果也类似，最优模型为1000～2502 nm使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.92、SECV=0.3284、R2 p=0.88、RPDP=2.93；其次为Lys973-97B谱区使用原始光谱所建，其R2 CAL=0.86、SECV=0.4066、R2 p=0.86、RPDP=2.67；1000～1599 nm区域使用原始光谱所建模型也较优，其R2 CAL=0.86、SECV=0.4114、R2 p=0.87、RPDP=2.74。

对于光谱预处理的作用，从表2、表3、表6的建模结果可以看出，在没有删除异常样本时，在1000～2502 nm建模谱区，使用SNV+gapsegment(1#,15,7)光谱所建模型优于原始光谱所建；在1000～1599 nm建模谱区，使用原始光谱所建模型优于SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱所建。在表6中，删除异常样本集1和集2后，原始光谱在5个建模谱区上所建模型的结果均优于SNV+gapsegment (1#,15,7)光谱所建模型。

对于异常样本剔除的作用，从表6中可以看出，删除异常样本集2后在5个谱区上所建模型均优于删除异常样本集1所建模型，删除异常样本集1和集2的建模效果均优于没有删除异常样本集，尤其表现在外部验证集中。

对于建模样本选取方法的作用，展晓日等[28]比较了随机取样法，Kennard-Stone(KS)、duplex、SPXY四种训练集取样法对橘叶橙皮苷NIRS模型的影响，结果表明，SPXY法选取的训练集建立的模型优于其他三种方法。在本研究中，从表2、表3、表5、表6的建模结果可以看出，删除异常样本后，SPXY取样法优于随机取样法（鸡种取样）。但在没有删除异常样本时，鸡种选择法的校正建模结果和交互验证结果均优于SPXY法的建模效果，但SPXY法外部验证和模型稳健性的结果要优于鸡种选择法的建模结果。因此，异常样本的剔除还需做深入研究。

对于特征光谱的作用，从表3和表5可以看出，使用FiPLS在全谱段筛选的建模谱区所建模型的校正建模结果优于按光谱特征筛选的建模谱区，但外部验证和模型稳健性的结果低于按光谱特征筛选的建模谱区。在按光谱特征筛选的建模谱区上使用BiPLS法筛选的建模谱区要优于FiPLS法。结合表6可以看出，Lys973-97B建模谱区相对于其他谱区建模结果的波动性最小，综合考虑到模型建模的难易度、精确性和适用性等方面，认为胸肌赖氨酸的建模特征谱区为Lys973-97B。Qu等[29]使用FiPLS、BiPLS、FBiPLS三种方法建立水中乙醇含量的定量预测模型，发现FBiPLS能改善FiPLS与BiPLS贪婪搜索的特性，对特征波段的选取更高效、更具代表性。陶琳丽等[22]使用FiPLS、BiPLS、FBiPLS三种方法筛选鸡腿肌冻干粉粗蛋白质NIRS模型的建模谱段，结果也表明FBiPLS法优选出的建模谱段建模结果最优。上述两项研究结果与本研究不一致。而仇逊超等[30]利用BiPLS和无信息变量消除法选取特征波段，建立全波段和特征波段下的带壳松子和松仁蛋白质近红外预测模型，结果表明BiPLS法筛选的谱段建模结果最优，与本研究结果一致。