何柳，王云鹏，谢卫红，张毅

（湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，“111计划”学科创新引智基地，湖北武汉430068）

艾蒿（Artemisia argyi Levl. et Van）又名艾草，艾萧等，为菊科多年生草本植物，是中国传统的天然植物资源。该植物作为药物始载于《名医别录》[1]，味苦而辛，无毒，具有清热止痰、温经止血等功效。我国艾蒿植物资源丰富，种类繁多，主要有蕲艾、赣艾、北艾、祁艾及海艾[2]，不同地区来源的艾叶微量元素含量相似，其中钾、钙、镁、铁含量较高[3,4]。艾叶为艾蒿的干燥成熟叶子，含有多糖类[5]、酚酸类[6]、黄酮类[7]、精油[8]、萜类[9]等多种活性物质，具有抗氧化[10]、抑菌[11]、抗疟药[12]等功效，有较好的研究价值以及较广泛的应用。

目前，因食源性致病菌引起的食物中毒事件频繁发生，食品腐败现象普遍存在，金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起急性中毒的原因，志贺氏菌引起的食物中毒在夏、秋两季多见，中毒食品以冷盘为主。沙门氏菌极易引起人食物中毒，中毒食品以蛋类、肉类及奶类为主；这三种细菌为常见的食源性致病菌，对人和动物危害大。人工合成抑菌剂的使用会导致耐药菌的产生[13]；以及慢性疾病的早期发生与人体内部的抗氧化水平密切相关，经人工合成的抗氧化剂可能致癌或者产生副作用。因此，一种安全、无毒的天然抗氧化剂、抑菌剂意义重大。

近年来，对天然植物活性成分的提取，一般采用水提法[14]、有机溶剂提取法[15]、酸碱提取法[16]；而对艾叶活性成分的提取，通常采用水提法[17]、醇提法[18]，酸提法未见报道。本研究以艾叶为原料，采用柠檬酸溶液和去离子水作为溶剂，得到艾叶酸提物和艾叶水提物；测各自的总黄酮、总多酚和多糖含量。比较两种艾叶提取物对DPPH自由基、羟自由基及ABTS自由基的清除能力；再探究两种艾叶提取物对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及沙门氏菌的抑菌效果，从而筛选出抗氧化活性较高、抑菌效果较好的艾叶提取物。以期为艾叶有效成分的提取提供技术支撑。此外，有关艾叶提取物的抑菌机理研究较少，本研究将从细胞膜完整性、菌体表面微观结构及蛋白质合成等方面来研究艾叶提取物的抑菌机理，为进一步开发艾叶新型功能性产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以湖北蕲春地区的艾蒿干燥叶子为原材料；以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、沙门氏菌（SalmonellaCMCC 21513）、痢疾志贺氏菌（SygassisCMCC(B) 51105）作为供试菌，由湖北省药检院赠与。

培养基：营养琼脂或Luria-Bertani培养基。

试剂：柠檬酸、无水乙醇、甲醇、氯化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、2.5%戊二醛，均属分析纯；1,1-二苯-2-三硝苯肼（DPPH）（D807297），纯度96%、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（A800764），纯度98%，购自上海源叶生物科技有限公司；钙离子试剂盒（C004-2-1），南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

KQ5200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；R-1001VN旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；YM100立式压力蒸汽灭菌器，上海三中医疗器械有限公司；ZXSD-B1270生化培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；EPOCH酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；JSM-6390LV扫描电子显微镜，日本电子；Chemi XL1.4高灵敏度化学发光成像系统，英国Syngene公司。

1.3 实验方法

1.3.1 两种艾叶提取物的制备

艾叶水提物的制备：将干燥的艾叶采用高压粉碎机粉碎，过200目筛，密封贮存备用。准确称取20 g艾叶样品，加入600 mL的去离子水，浸泡过夜，先采用200 W超声提取30 min后，再水浴加热2 h，水浴温度为80 ℃，趁热纱布过滤，抽滤取上清液，真空冷冻干燥后，密封保存。

艾叶酸提物的制备：准确称取20 g艾叶，加入600 mL的去离子水，再用柠檬酸溶液调至pH 4.0，浸泡过夜；后续步骤与艾叶水提物相同。

1.3.2 总黄酮、总多酚及多糖含量的测定

1.3.2.1 总黄酮含量测定

采用亚硫酸钠-硝酸铝显色法[19]测定总黄酮含量，精密吸取艾叶提取物0.5 mL，依次加入0.15 mL 5%NaNO2溶液，静置6 min后加入0.15 mL 10%AlCl3·6H2O溶液，静置5 min再加入2 mL 4% NaOH溶液，最后加入2.2 mL蒸馏水，使用酶标仪测量510 nm处的吸光值以芦丁为标准品，在0～0.0416 mg/mL浓度范围内，获得标准曲线方程：Y=4.3693X-0.0003（R2=0.9992）。将结果换算为每克干基中所含的总黄酮相当于芦丁的毫克数（mg RE/g DW）。

1.3.2.2 总多酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法[20]测定总多酚含量，精密吸取艾叶提取物1 mL，依次加入1 mL Folin-Ciocalteu显色剂及2 mL 12% Na2CO3溶液，用水定容至10 mL，室温避光反应1 h后，使用酶标仪测量765 nm处的吸光值，以没食子酸为标准品，在0～0.015 mg/mL浓度范围内，获得标准曲线方程：Y=38.681X+0.008（R2=0.9991）。将结果换算为每克干基中所含的多酚相当于没食子酸的毫克数（mg GAE/g DW）。

1.3.2.3 多糖含量测定

采用蒽酮-硫酸法[21]测定多糖含量，精密吸取艾叶提取物1 mL，再加入4 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液，沸水浴10 min，冰水浴5 min。使用酶标仪测量585 nm处的吸光值，以葡萄糖为标准品，在0～0.1 mg/mL浓度范围内，得到回归方程为：Y=1.6081X-0.0003（R2=0.9993）。将结果换算为每克干基中所含的多糖相当于葡萄糖的毫克数（mg DE/g DW）。

1.3.3 抗氧化能力测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参考周庆光等[22]、Chen等[22]方法，稍作修改。精密吸取不同质量浓度的样品溶液100 μL于96孔板中，分别加入0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液100 μL；避光反应30 min，使用酶标仪测量517 nm处的吸光值。空白组以100 μL的去离子水代替样品溶液，本底组为甲醇，抗坏血酸（Vc）用作阳性对照。

式中：

A0——空白管吸光度；

As——测定管吸光度；

Ac——测定管本底吸光度。

1.3.3.2 羟自由基清除能力的测定

羟自由基（·OH）清除能力的测定参照文献[24]。精密吸取不同质量浓度的样品溶液1 mL，依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1 mL 9 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴30 min后，取出，精密吸取200 μL测定液于96孔板中，使用酶标仪测定510 nm处吸光值。空白组为去离子水代替样品溶液，本底用超纯水代替H2O2溶液。抗坏血酸（Vc）用作阳性对照。

式中：

A0——空白管吸光度；

As——测定管吸光度；

Ac——测定管本底吸光度。

1.3.3.3 ABTS自由基清除能力的测定

ABTS自由基清除能力的测定参考文献[25]。将7 mmol/L ABTS溶液和4.95 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，在室温下避光反应14 h后，用PBS溶液稀释至OD734为0.70±0.02。精密吸取50 μL不同质量浓度的样品溶液于96孔板中，加入200 μL ABTS-过硫酸钾溶液，混匀，室温反应6 min；使用酶标仪测定734 nm处吸光值。抗坏血酸（Vc）用作阳性对照。

式中：

A0——空白管吸光度；

As——测定管吸光度；

Ac——测定管本底吸光度。

1.3.4 抑菌活性的测定

1.3.4.1 菌悬液的制备

分别将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Sygassis）接种到Luria-Bertani培养基中，37 ℃摇床培养12 h，用Luria-Bertani培养基稀释，使菌悬液浓度约为1×107CFU/mL，备用。

1.3.4.2 抑菌效果与最小抑菌浓度（minimum inhibition concentration，MIC）的测定

采用牛津杯法[26]对抑菌效果及MIC进行测定。在无菌环境中，向含有营养琼脂培养基的平皿中加入100 μL浓度为107CFU/mL的菌悬液，涂抹均匀，每个平皿等距放3个牛津杯（直径为8 mm），每个牛津杯中加入200 μL不同质量浓度的样品溶液；以pH 4.0柠檬酸溶液为对照组，于37 ℃培养8～12 h后，测量抑菌圈大小。

1.3.5 抑菌机制的测定

1.3.5.1 抑菌动力学的测定

将菌悬液与样品溶液的等体积混合，使样品溶液终浓度分别为MIC、2×MIC，将混合物于（37 ℃、180 r/min）下孵育0、1、2、4、6、10、24 h。以pH 4.0柠檬酸溶液为对照组，用酶标仪测量上清液的OD600值，并根据吸光度值绘制曲线[27,28]。

1.3.5.2 细胞膜通透性的测定

将菌悬液与样品溶液的等体积混合，使样品溶液终浓度为MIC，以pH 4.0柠檬酸溶液为对照组；将混合物于（37 ℃、180 r/min）下孵育0、1、2、4、6 h。离心（5000 g，10 min）取上清液；使用钙离子试剂盒测量上清液的OD610值，并根据吸光度值绘制曲线[29]。

1.3.5.3 菌体显微结构的观察

参照Zhou等[30]实验方法：将菌悬液与样品溶液的等体积混合，使样品溶液终浓度为MIC，对照组为pH 4.0柠檬酸溶液。将混合物于（37 ℃、180 r/min）下孵育8 h，离心（8000 g，15 min），收集细胞沉淀，用2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗2次，再用梯度乙醇（30%、70%、90%、100%）脱水，离心取沉淀，加入0.5 mL无水乙醇溶液，真空冷冻干燥后，喷金处理，扫描电镜观察。

1.3.5.4 菌体蛋白质合成的测定

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定蛋白含量[31,32]。将1 mL艾叶酸提物与1 mL菌悬液等体积混合，置于（37 ℃、180 r/min）摇床中孵育6 h，对照组为pH 4.0的柠檬酸溶液；离心取沉淀，PBS重悬，再加入10 μL 5×蛋白Loading Buffer，沸水浴5～10 min，取出，4 ℃保存，备用。安装好电泳装置后，每孔3 μL点样，调电压至80 V开始电泳，待溴酚蓝进入分离胶后120 V跑至胶底，将胶块放置纯水中，摇床脱色两次；直到条带清晰后使用化学发光成像系统拍照记录结果。

1.4 数据处理与统计分析

采用excel统计软件进行数据分析，所有实验均重复三次取其平均值；采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析（p<0.05表示差异显著）；采用Origin 9.0软件对实验结果作图。

2 结果与分析

2.1 总黄酮、总多酚及多糖含量

由表1可知，艾叶酸提物与艾叶水提物中总黄酮、总多酚及多糖含量均具有显著性差异（p<0.05）。艾叶酸提物中总黄酮、总多酚和多糖含量分别是艾叶水提物的38.64%、49.14%、113.73%；即艾叶酸提物中总黄酮、总多酚含量均低于艾叶水提物，但多糖含量高于水提物。李美萍[33]测得艾叶水提物中总黄酮含量为12±2.52 mg RE/g DW，总多酚含量为40±1.53 mg GAE/g DW，本研究艾叶水提物中总黄酮和总多酚含量比其高。

表1 两种艾叶提取物的总黄酮、总多酚及多糖含量Table 1 Contents of total flavonoids, total phenols and amylose of two Artemisiae argyi extracts

2.2 体外抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力分析结果

如图1所示，在2.5～80 μg/mL质量浓度范围内，两种艾叶提取物的DPPH自由基的清除能力随浓度的增加而增大。当浓度为80 μg/mL时，艾叶水提物、艾叶酸提物和Vc对DPPH自由基清除率分别为91.40%、66.05%和96.28%，IC50值分别为33.10、54.52和6.25 μg/mL，对DPPH自由基清除能力大小依次为：Vc>艾叶水提物>艾叶酸提物。即艾叶水提物对DPPH的清除效果强于艾叶酸提物，这可能与水提物中含有更多的黄酮类及酚类化合物有关。

图1 两种艾叶提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of two Artemisiae argyi extracts

2.2.2 羟自由基清除能力分析结果

如图2所示，在0.08～5.12 mg/mL的质量浓度范围内，随着浓度的增大，两种艾叶提取物对·OH的清除能力也增大，呈现出剂量依赖性。Liu等[34]研究证实了样品浓度与抗氧化活性具有显著相关性。当浓度为0.64 mg/mL时，艾叶水提物和酸提物的·OH清除率分别为18.37%和29.24%，远小于Vc在0.64 mg/mL时的·OH清除率（99.83%，p<0.01）。艾叶水提物、艾叶酸提物和Vc的·OH清除率IC50值分别为2.92、1.63和0.19 mg/mL，对羟自由基清除能力大小依次为：Vc>艾叶酸提物>艾叶水提物。这可能与艾叶酸提物中多糖含量较高有关，也可能是酸提物中含有其他活性物质。

图2 两种艾叶提取物对羟自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of two Artemisiae argyi extracts

2.2.3 ABTS自由基清除能力分析结果

如图3所示，在0.08～5.12 mg/mL的质量浓度范围内，两种艾叶提取物对ABTS自由基清除率随浓度增加而增大，当浓度为0.32 mg/mL时，艾叶水提物、艾叶酸提物和Vc的ABTS自由基清除率分别为90.22%、55.91%和99.71%；此浓度下，两种艾叶提取物对ABTS自由基的清除率差异显著（p<0.01）。艾叶水提物、艾叶酸提物和Vc的ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.17、0.32和0.049 mg/mL，对ABTS自由基清除能力大小依次为：Vc>艾叶水提物>艾叶酸提物。这可能与水提物中含有更多的黄酮类及酚类化合物有关，与上述两种艾叶提取物的DPPH自由基清除能力相同。

图3 两种艾叶提取物对ABTS自由基的清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging ability of two Artemisiae argyi extracts

2.3 艾叶提取物的抑菌活性

由表2可知，两种艾叶提取物抑菌效果存在显著差异（p<0.05），艾叶水提物对3种食源性致病菌无明显抑制作用，艾叶酸提物对3种食源性致病菌有显著抑菌活性。

表2 艾叶提取物的抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone of Artemisiae argyi extracts

如图4所示，艾叶酸提物对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌均有较强的抑制作用，且对照组无明显抑制作用；可能是酸提物中含有特殊的活性成分，或者与酸提物中多糖类物质含量较高有关。当浓度为0.4 g/mL时，艾叶酸提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为18.47 mm，对沙门氏菌的抑菌圈直径为15.11 mm，抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>志贺氏菌>沙门氏菌；表明艾叶酸提液对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌；可能与革兰氏阴/阳性菌的细胞壁结构不同有关。甘昌胜等人[17]表明艾叶水提液抑菌效果一般；毛跟年等人[35]表明野艾蒿水相组分没有抑菌活性；与本研究结果一致。

图4 艾叶酸提物的抑菌效果图Fig.4 The antibacterial effect diagram of Artemisiae argyi acid extract

2.4 艾叶酸提物的抑菌机理

2.4.1 艾叶酸提物的最小抑菌浓度

基于两种艾叶提取物的抑菌效果，进一步探讨了艾叶酸提物的最小抑菌浓度（MIC）及抑菌机制。由表3可知，艾叶酸提物对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的MIC均为0.1 g/mL，对沙门氏菌的MIC为0.2 g/mL，且抑菌效果随艾叶酸提物浓度的增加而增加（p<0.05）。Yuan等[29]研究证明了抑菌效果与提取物浓度呈正相关。

表3 艾叶酸提物对细菌的最小抑菌浓度Table 3 MIC of the Artemisiae argyi acid extract on bacteria

2.4.2 艾叶酸提物的抑菌动力学结果

由图5可知，当艾叶酸提物作用细菌24 h后，MIC组、2×MIC组中3种细菌的OD600均小于对照组；与0 h相比，3种细菌的OD600均无明显变化；表明MIC、2×MIC浓度的艾叶酸提物都能有效抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的生长繁殖。艾叶酸提物浓度越大，抑制效果越好。

图5 艾叶酸提物对细菌的抑菌动力图Fig.5 Antibacterial dynamics of Artemisiae argyi acid extract on bacteria

2.4.3 艾叶酸提物对致病菌细胞膜通透性的影响

Ca2+是维持细菌细胞膜渗透压平衡的重要电解质，细胞膜被破坏，会导致细菌体内电介质的泄露，上清液中Ca2+含量变化可反映细菌细胞膜通透性的改变[29]。如图6所示，在0～6 h范围内，随培养时间的增加，对照组中3种菌体上清液的OD610无明显变化（p<0.05），表明菌体细胞内Ca2+含量保持稳定，而1×MIC组OD610有显著增大趋势，说明上清液中Ca2+含量增加，上述结果表明艾叶酸提物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的细胞膜都造成了不同程度的破坏，使细胞膜原有的功能降低或者丧失，流动性降低，通透性增加，细胞内Ca2+等电解质泄露。Zhang等[29]研究证实了Ca2+的释放量与样品浓度呈正相关。

图6 艾叶酸提物对细菌体内Ca2+含量的影响Fig.6 The effect of Artemisiae argyi acid extract on the content of Ca2+ in bacteria

2.4.4 艾叶酸提物对菌体细胞显微特征的影响

如图7所示，用艾叶酸提物处理过的细菌细胞壁形态与对照组相比，差异显著。对照组中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌细胞形态完整，表面光滑，分散均匀，细胞壁界限清晰；MIC组中3种致病菌形态不完整，菌体断裂、破碎、残缺、大量内容物流出，由上述结果表明，艾叶酸提物能对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的细胞质膜和细胞壁产生严重影响。

图7 经艾叶酸提物处理后细菌的扫描电镜图Fig.7 SEM of bacteria treated with Artemisiae argyi acid extract

2.4.5 艾叶酸提物对致病菌细胞蛋白质合成的影响

如图8所示，经艾叶酸提物处理过的细菌蛋白质谱与对照组存在显著差异。对照组（1、3、5）蛋白质条带清晰明亮、灰度很深；经1×MIC艾叶酸提物处理后的蛋白质条带（2、4、6）整体灰度明显变浅、模糊暗淡，表明蛋白质浓度降低；这可能是因为艾叶酸提物对菌体内蛋白质的合成有抑制作用，也可能是因为其抑制了细菌的生长繁殖，而导致蛋白质含量变少。Zhou等[30]利用SEM和SDS-PAGE证实了栎木的缬草和贝壳对细胞质膜的破坏性作用；与本研究的扫描电镜和凝胶电泳结果相似，表明细胞膜和细胞壁的完整性是影响细菌正常生长和代谢的重要因素。

图8 艾叶酸提物对细菌细胞蛋白质合成的影响Fig.8 Effect of Artemisiae argyi acid extract on protein synthesis of bacterial cells

3 结论

3.1 本研究表明艾叶水提物和酸提物的成分组成、体外抗氧化及抗菌作用存在差异，艾叶酸提物更具有作为天然食品防腐剂和抗氧化剂的潜力。艾叶酸提物中总黄酮、总多酚和多糖含量分别是艾叶水提物的38.64%、49.14%和113.73%。艾叶水提物和艾叶酸提物均有较强抗氧化能力，对DPPH自由基清除率的IC50值分别为33.10和54.52 μg/mL；对羟自由基清除率的IC50值分别为2.92和1.63 mg/mL；对ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.17和0.32 mg/mL。

3.2 艾叶水提物无明显抑菌效果，而艾叶酸提物具有显著抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的MIC均为0.1 g/mL，对沙门氏菌的MIC为0.2 g/mL；抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>志贺氏菌>沙门氏菌。抑菌机制研究表明：艾叶酸提物可改变细胞膜的通透性，破坏细胞壁的完整性，抑制菌体蛋白质的合成，从而破坏菌体细胞结构，导致细菌不能正常生长繁殖。

3.3 本研究为提取艾叶活性成分开辟了新途径，克服了艾叶水提物无明显抑菌效果的问题。后续我们将深入研究艾叶酸提物中具体的有效成分，进一步分离纯化，并鉴定艾叶酸提物中抗氧化及抗菌的活性物质，从而更深层次揭示酸提法对艾叶活性功能的影响，为进一步开发艾叶新型功能性产品提供理论依据。