李璐，徐玉娟，吴继军，余元善，邹波，彭健

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

树莓（Rubus corchorifoliusL. f.），蔷薇科悬钩子属小浆果，又称山莓、覆盆子，是一种重要的园艺作物，分布于全球温带地区，尤其是美洲和欧洲[1,2]，在我国主要分布于东北、华北等地区，其果实营养价值丰富、风味独特广受消费者喜爱[3]。树莓果实中富含花青素、黄酮、鞣花单宁等对人体有益的多种活性物质，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病和抗癌等功效[4-6]，有着“金色水果”的美誉[5]。在我国，树莓自古以来就被广泛用于肾遗尿和尿频的治疗，具有极高的药用价值[7]。然而，树莓果实保质期极短，当树莓果实成熟后，由于其呼吸速率较高，导致其硬度和新鲜度迅速下降，极易发生腐烂变质现象[8]。将东北、华北地区的树莓运输至华中地区，腐烂率较一般水果高，因此，华中地区市面上可供鲜食的树莓果实较少[3,9]。近年来，树莓在华中地区栽培成功，减少了运输成本。但不同种植地区树莓果实的营养物质组成和含量存在较大差异，目前尚未有关于华中地区树莓果实特征性活性物质的研究，制约了华中地区树莓果实的开发利用。

酚类物质是水果中一类重要的活性物质，其含量受多种因素影响，例如生长环境、品种和成熟阶段等[10]。有研究表明，成熟的蔓越莓果实中总酚含量远高于未成熟蔓越莓果实[11]，而成熟苹果中总酚含量显著低于未成熟苹果[8]。水果中的酚类物质大体可分为花色苷类和非花色苷类酚类物质。花色苷是影响水果色泽和成熟度的重要因素，通常在水果成熟过程中积累[8]。鞣花单宁是悬钩子属浆果中一类特有的非花色苷类酚类物质[12]。研究发现，花色苷和鞣花单宁是树莓果实中重要的活性物质，具有清除自由基、抗癌等功能[6,8]。其中，矢车菊素3-O-槐糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、地榆素H-6和Lambertianin C是树莓果实中含量较高的酚类物质[13]。然而，不同品种树莓果实酚类物质的组成和含量具有较大差异[8]。

超氧化物歧化酶是一种具有抗氧化活性的金属酶，是对抗超氧阴离子自由基的第一道防线[14]。机体内超氧阴离子自由基的存在会导致癌症、心血管疾病和衰老。因此，超氧化物歧化酶被报道具有抗癌、抗衰老的作用[15]，常作为一种外源添加剂添加至医药、饮料和保健食品中[16]。目前，超氧化物歧化酶主要从动物体内获得，但这存在生物污染和伦理道德问题[17]。因此，研究人员对具有高活性超氧化物歧化酶植物的关注日益增加[15]。有研究发现，超氧化物歧化酶是树莓中主要的抗氧化物质[18]。因此，超氧化物歧化酶可作为树莓果实的特征活性物质。然而，目前关于树莓果实超氧化物歧化酶的研究较少。基于此，本研究通过分析四种生长在华中地区的树莓在其果实成熟过程中总酚、总花色苷、花色苷类酚类物质、非花色苷类酚类物质和超氧化物歧化酶的变化，解析华中地区不同品种树莓果实成熟过程中特征活性物质的变化规律，为华中地区树莓果实的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

秋福、美22、哈尔特兹和天门三号树莓果实采自湖北天门树莓园，根据表1将其成熟过程分为4个阶段。密封冷冻避光运回广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，-20 ℃保藏。标准品：矢车菊素3-O-槐糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、树莓酮、鞣花酸和没食子酸，购自于上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均购自于广州市泰昌生物科技有限公司。

表1 树莓果实成熟阶段的分级标准Table 1 Grading criteria for raspberry fruits ripening stages

1.2 主要仪器与设备

LLJ-206J多功能料理机，江门市贝尔斯顿电器有限公司；UV-1900i紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Infinite M200pro酶标仪，瑞士TECAN公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪，加拿大SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 树莓果实活性物质含量测定

1.3.1.1 酚类化合物的提取

将树莓果实均匀制浆，精确称取10 g匀浆液加入到10 mL提取液（甲醇:盐酸=99:1）30 ℃超声处理10 min，5000 r/min离心5 min，收集上清液，沉淀继续提取3次，合并上清液，用于酚类化合物和抗氧化活性的评价[19]。

1.3.1.2 总酚含量的测定

采用Folin Ciocalten法[8]对树莓果实总酚含量进行测定，将1 mL提取液与2 mL斐林试剂和2 mL碳酸钠溶液混合，混合液避光反应60 min，于760 nm处检测其吸光值，树莓果实总酚含量以每克树莓果实中没食子酸当量（毫克）数计。

1.3.1.3 总花色苷含量的测定

采用pH示差法[8]对树莓果实总花色苷含量进行测定，将提取液分别加入到0.025 mol/L KCl（pH=1.0）和0.4 mol/L CH3COONa（pH=4.5）中，均匀混合后避光反应15 min，分别在510 nm和700 nm处检测吸光值。树莓果实总花色苷含量按照公式（1）进行计算：

式中：

MW=449.2；

ε——矢车菊素3-葡萄糖苷摩尔消光系数，29600 L/(mol·cm)；

A510、A700——510 nm、700 nm处的吸光值。

1.3.1.4 鞣花单宁的提取

鞣花单宁的提取参考MichałSójka等[20]的方法。将树莓果实均匀制浆，精确称取10 g匀浆液加入到30 mL 60%丙酮提取液，30 ℃超声处理10 min，5000 r/min离心5 min，收集上清液，沉淀继续提取2次，合并提取液，旋转蒸发去除丙酮后采用XAD 1600N大孔吸附树脂对其进行纯化，收集40%乙醇洗脱液，旋转蒸发浓缩后用于鞣花酸和鞣花单宁的结构鉴定。

1.3.1.5 树莓果实中花色苷的结构鉴定

树莓果实中花色苷的结构鉴定使用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪进行，方法参考MichałSójka等[20]的方法，并略有改动。取1 mL提取液经0.22 μm滤膜过滤后待测。色谱条件：色谱柱为Wondasil C18柱（250×4.6 mm，5 μm，日本岛津）；流动相为4%磷酸溶液（A）和乙腈（B）。洗脱程序为：0～10 min，8% B；10～55 min，8%～18% B；55～65 min，18%～45% B；65～65.01 min，45%～70% B，65.01～70 min，70%～70% B。进样量为10 μL，流速为1 mL/min，检测器为二极管阵列检测器，柱温为35 ℃。质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），正离子扫描模式，扫描范围100～1000 u，毛细管电压4.5 kV，雾化器压力1.5 bar，毛细管温度220 ℃，干燥气体流速6.0 L/min。

1.3.1.6 树莓果实中鞣花酸和鞣花单宁的结构鉴定

树莓果实中鞣花酸和鞣花单宁的结构鉴定使用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪进行，方法参考MichałSójka等[20]的方法。取1 mL提取液经0.22 μm滤膜过滤后待测。色谱条件同花色苷的结构鉴定。质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），负离子扫描模式，一级质谱扫描范围100～2000 u，二级质谱扫描范围100～1500 u，毛细管电压4.0 kV，雾化器压力1.5 bar，毛细管温度400 ℃，干燥气体流速20.0 L/min。

1.3.1.7 树莓果实中酚类化合物的定量分析

采用高效液相色谱法测定树莓果实中酚类化合物的含量。液相色谱条件同结构鉴定，外标法定量，根据标准品的浓度和峰面积绘制标准曲线，标曲浓度范围为2.5～100 μg/mL，鞣花单宁以鞣花酸含量定量。

1.3.1.8 树莓果实中超氧化物歧化酶活性的测定

使用比色分析试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）根据说明书检测树莓果实中的超氧化物歧化酶的活性[21]。

1.3.2 数据处理

每组实验设置3次重复，数据以为平均值±标准差表示，采用Excel、Origin 8.5、SPSS 23、PeakView对数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 四种树莓果实成熟过程中总酚和总花色苷含量的变化

众所周知，由于浆果类水果含有丰富的活性物质，使其具有多种生物活性，例如抗氧化、抗癌、扩张血管和抗菌等[22]。其中，起主要作用的物质是酚类化合物[23]。因此，评价不同种类树莓成熟过程中总酚含量的变化是尤为必要的。根据树莓果实的颜色将其成熟过程分为四个阶段（表1）：S1阶段（绿色）、S2阶段（粉色）、S3阶段（红）和S4阶段（深红）。由图1a可知，随着树莓果实的成熟，其总酚含量呈下降趋势。树莓果实总酚含量最高的阶段在S1，其中美22树莓果实中的总酚物质含量最高（31.94 mg/g FW），与已有报道结果是一致的[8]。而在S3和S4阶段，四种树莓果实的总酚含量没有显著性差异。

图1 四种树莓果实成熟过程中总酚（a）和总花色苷（b）含量的变化Fig.1 Changes in total phenolics (a) and total anthocyanins (b)contents of four cultivars during raspberry fruit ripening

有研究表明，树莓果实含有较高的花色苷含量，使其具有较强的抗氧化活性[23]。因此，针对四种树莓果实成熟过程中总花色苷含量的变化也进行了研究。由图1b可知，四种树莓果实成熟过程中总花色苷含量呈上升趋势，从其颜色的变化也可看出，树莓果实成熟过程中其颜色逐渐由绿变红；在S4阶段，四种树莓果实的总花色苷含量均达到最高，其中美22树莓果实总花色苷含量最高（1311.27 mg/kg FW），这表明树莓果实中花色苷的形成和积累主要发生在树莓果实成熟过程中的S4阶段。Yang等[8]也发现树莓果实成熟过程中总花色苷含量不断升高，尤其在树莓果实成熟的末期，其总花色苷含量急剧升高。

2.2 树莓果实酚类物质的结构鉴定

花色苷是一类重要的天然有机化合物，广泛存在于浆果中，它不仅可用为食用型色素，而且对预防肿瘤、心血管等疾病有重要作用[5]。鞣花单宁与花色苷均是树莓果实的代表性酚类化合物。为进一步研究树莓果实成熟过程中特征活性物质的变化，采用高效液相色谱联合四级杆飞行时间质谱对树莓果实单体酚进行解析。根据一级质谱分子量、二级碎片以及紫外可见光谱、标准品的保留时间及参考文献，共鉴定出9种单体酚，包括5种花色苷，矢车菊素3-O-槐糖苷、矢车菊素3-(2''-O-葡萄糖)芸香苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香苷和天竺葵素3-O-葡萄糖苷；3种鞣花单宁，Lambertianin C，地榆素H-6（sanguiin H-6），鞣花酸；树莓酮（表2）。

表2 液相质谱联用鉴定树莓果实中花色苷类和非花色苷类酚类化合物Table 2 LC-MS Identification of anthocyanin and non- anthocyanin phenolic compounds in raspberry fruit

酚类化合物的结构鉴定以矢车菊素3-O-槐糖苷为例，其他化合物的结构鉴定类似。根据[M+H]+精确母离子分子量611.16068 u推测其分子式为C27H31O16，二级碎片ms/287为典型的矢车菊素分子量，ms/449与ms/287相差162 u，推测为矢车菊素六碳糖苷，ms/611与ms/449相差162 u，推测为矢车菊素-六碳糖-六碳糖苷，然后根据标准品的保留时间，以及标准品相同的紫外可见光谱图（λmax279 nm和515 nm），确定其为矢车菊素3-O-槐糖苷。

2.3 树莓果实成熟过程中花色苷的变化

从表3可以看出，品种和成熟阶段对树莓果实花色苷组成和含量影响较大；矢车菊素3-O-槐糖苷，矢车菊素3-O-葡萄糖苷，矢车菊素3-(2''-O-葡萄糖)芸香苷和矢车菊素3-O-芸香苷是树莓果实中主要的花色苷，与已有研究结果是相同的[13,24]。矢车菊素3-O-槐糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷在四种树莓果实中均可检测到，在秋福、美22和天门三号树莓果实中均可检测到矢车菊素3-(2''-O-葡萄糖)芸香苷和矢车菊素3-O-芸香苷，而天竺葵素3-O-葡萄糖苷仅在美22和哈尔特兹树莓果实中检测到。5种花色苷类化合物在树莓果实的成熟过程中均呈上升趋势。四种树莓果实完全成熟时，花色苷含量为美22（1311.3 mg/kg FW）>秋福（766.46 mg/kg FW）>哈尔特兹（755.96 mg/kg FW）>天门三号（565.73 mg/kg FW）；秋福中矢车菊素3-O-芸香苷的含量最高（171.14 mg/kg FW）；美22树莓果实中矢车菊素3-O-葡萄糖苷和天竺葵素3-O-葡萄糖苷的含量最高，分别为797.94和19.45 mg/kg FW；哈尔特兹树莓果实中矢车菊素3-O-槐糖苷的含量最高（473.05 mg/kg FW）；天门三号树莓果实中矢车菊素3-(2''-O-葡萄糖)芸香苷的含量最高（196.48 mg/kg FW）。以上结果表明，不同品种树莓果实成熟过程中其花色苷组成和含量存在差异[25]。Chen等[26]研究了15种树莓果实中花色苷的含量和组成，根据花色苷的组成和含量可将15种树莓果实分为3组，深红色和黑色树莓果实组的花色苷含量均达4633 mg/100 g DW，且其主要的花色苷类酚类化合物为矢车菊素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-O-芸香苷；而粉红色组树莓果实花色苷含量仅有704 mg/100 g DW，其主要花色苷类为矢车菊素3-O-槐糖苷和矢车菊素3-（2''-O-葡萄糖）芸香苷。Yang等[8]也发现不同成熟阶段树莓果实中花色苷类化合物组成和含量有较大差异。

表3 四种树莓果实成熟过程中5种花色苷酚类化合物的含量（mg/kg FW）Table 3 Quantification of 5 anthocyanin phenolic compounds in four cultivars at different ripening stages of raspberry fruit

2.4 四种树莓果实成熟过程中非花色苷酚类物质含量的变化

从四种树莓果实中共鉴定出4种非花色苷类酚类物质，分别是Lambertianin C、地榆素H-6、树莓酮和鞣花酸（表4）。其中，鞣花酸、Lambertianin C和地榆素H-6属于鞣花单宁类物质[20]。而树莓酮是唯一一种能够产生天然树莓果实果香的物质，可有效促进脂质代谢，从而达到减脂的作用[27]。四种树莓果实中Lambertianin C和地榆素H-6的含量均远高于鞣花酸的含量，与已有报道结果一致[23]，鞣花鞣质类化合物只有经酸解或碱解后才会大量形成鞣花酸。Gasperotti等[28]也发现Polka和Polana树莓品种果实中的Lambertianin C和地榆素H-6含量占总鞣花单宁类物质含量的64%。除秋福树莓果实外，美22、哈尔特兹和天门三号树莓果实在其成熟过程中Lambertianin C，地榆素H-6和树莓酮的含量均呈逐渐下降的趋势。而鞣花酸在四种树莓果实成熟过程中均呈先下降后上升的趋势。当四种树莓果实完成成熟时，美22树莓果实中Lambertianin C、地榆素H-6、树莓酮和鞣花酸的含量均为最高，分别为166.27、208.93、2.64和33.02 μg/g FW。

表4 四种树莓果实成熟过程中4种非花色苷酚类物质的含量（μg/g FW）Table 4 Quantification of 4 non-anthocyanin phenolic compounds in four cultivars at different ripening stages of raspberry fruit

2.5 四种树莓果实成熟过程中超氧化物歧化酶活性的变化

水果中天然存在的内源性酶对其质构、风味和颜色有较大影响，例如酯酶和果胶酶能够直接影响水果的成熟度和风味[29,30]。超氧化物歧化酶也是一种水果中常见的内源性酶，它可以用来反映水果的抗氧化活性，具有抗癌、抗心血管疾病和延缓衰老等功能[14]。因此，研究树莓果实过程中超氧化物歧化酶活性的变化是尤为必要的。如图2所示，除美22树莓果实外，其他三种树莓果实成熟过程中超氧化物歧化酶的活性均呈下降趋势，而美22树莓果实成熟过程中超氧化物歧化酶的活性呈先上升后下降的趋势。当树莓果实完全成熟后，天门三号树莓果实中超氧化物歧化酶的活性是最低的，仅有495.01 U/g FW。以上结果表明，四种树莓果实成熟过程中超氧化物歧化酶活性总体呈下降趋势。

图2 四种树莓果实成熟过程中总超氧化物歧化酶活性的变化Fig.2 Changes in superoxide dismutase activity of four cultivars during raspberry fruit ripening

3 结论

本研究解析了不同成熟阶段四种树莓果实中总酚、总花色苷、花色苷类酚类物质、非花色苷类酚类物质、超氧化物歧化酶的变化规律，在四种树莓果实成熟过程中，总酚含量和超氧化物歧化酶活性呈下降趋势，而其总花色苷含量呈上升趋势；采用超高效液相色谱-串联质谱仪鉴定出9种单体酚类物质，分别为矢车菊素3-O-槐糖苷、矢车菊素3-(2''-O-葡萄糖)芸香苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、Lambertianin C、地榆素H-6、树莓酮和鞣花酸；通过对单体酚定量分析发现，矢车菊素3-O-槐糖苷和矢车菊素3-O-葡萄糖苷是树莓果实主要的花色苷类酚类物质，Lambertianin C和地榆素H-6是树莓果实主要的非花色苷类酚类物质。以上研究结果表明，树莓果实的品种和成熟阶段对其特征活性物质有较大的影响，根据不同的需求选择合适的树莓果实。本研究为我国中部地区树莓果实的开发利用提供了理论依据。