余梅霞，朱 玉，程 丹，陆 娟

（阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）

纤维素是世界上最丰富的天然有机高分子化合物，是植物的结构多糖及某些真菌和细菌细胞壁的主要成分，是D-葡萄糖通过β-1,4 糖苷键连接的线性同多糖。纤维素、半纤维素和木质素是农作物秸秆的主要组成成分，但是它们在不同秸秆种类或同一种作物秸秆不同部位的含量不同[1]。我国是一个农业大国，每年约产生7 亿t 农作物秸秆[2]。虽然农作物秸秆是一种可再生的生物质资源，大部分却没有得到充分有效的利用。

目前，加速纤维素降解最常见的方法有物理法、化学法、生物法和它们相互结合的方法，但各有优缺点[3]。物理法对环境安全无污染，但设备投资大，能耗多；化学法（酸或碱）处理对仪器的耐腐蚀性要求较高，还存在回收、中和与洗涤等复杂工序；虽然以微生物为代表的生物法反应时间较长，但是反应的条件较温和，对设备要求较低，后续工作不复杂。因此，筛选、研究具有纤维素降解能力的菌株成为一个研究热点。研究发现，奥尔森青霉（Penicillium olsonii）[4]、伯氏短杆菌（Brevibacillus boorstelensis）[5]、努比卤地无氧芽孢杆菌（Anoxybacillus rupiensis）[6]和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[7,8]等菌株都具有降解纤维素的能力。

为了进一步寻找具有纤维素降解能力的菌株，不断开发纤维素降解菌的潜能，仍需继续筛选、分离纤维素降解菌。本文从酒糟泥中筛选具有降解纤维素能力的菌株，并对优势菌株进行初步鉴定，丰富了纤维素降解菌资源，为进一步研究该菌株的纤维素酶酶学性质及酶的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器

高压蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS）、超净工作台（SW-CJ-1F）、生化培养箱（SPX-250B-Z）、PCR仪（T100）、电泳仪（DYY-11）、高速台式离心机（TGL-20B）、紫外分光光度计（723N）、扫描电子显微镜（Sigma 500）。

1.2 培养基

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.1，KH2PO40.5，CaCl20.1，K2HPO42，CMC-Na 10，(NH4)2SO42，琼脂15，pH 7.0～7.4。121℃灭菌20 min。

滤纸酶（FPase）活检测培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠1.5，新华滤纸0.05，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0。121℃灭菌20 min。

1.3 土壤来源

从阜阳职业技术学院省级酿酒技术工程实践教育中心的酒窖中取酒糟泥，均质袋密封保存。

1.4 纤维素降解菌的筛选

1.4.1 初筛

将10 g 土样加入到装有90 mL 无菌水的锥形瓶中（内有少量玻璃珠），摇匀，此时浓度为10-1。取1 mL 混合液依次用9 mL 无菌水进行梯度稀释，获得10-2、10-3、10-4、10-5和10-6浓度的混合菌液。分别从10-3、10-4、10-5和10-6四个梯度吸取200 μL 混合液涂布于CMC-Na 平板，37℃培养箱中倒置培养2 d，挑选长势良好的单菌落进行平板划线法分离纯化，LB 斜面保种，4℃保存备用。

1.4.2 复筛

从初筛获得的菌株中挑取单菌落点种于CMC-Na 平板上，37℃培养箱中倒置培养2 d，刚果红染色复筛，方法同文献[9]。观察并测定透明圈的直径与菌落直径，通过比较前者与后者的比值大小来判定各菌株降解纤维素能力的强弱。

1.5 葡萄糖标准曲线的绘制

称取100℃干燥0.5 h 的葡萄糖粉末0.1 g，蒸馏水定容至100 mL。分别取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.4 mL 置于8 只试管中，用蒸馏水补足至2 mL。向每只试管中加入DNS溶液3 mL，煮沸10 min，冷却后用蒸馏水定容至20 mL，测量OD540值。以OD540为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制葡萄糖标准曲线（图1），得回归方程y=0.2551x+0.0113，R²=0.9929。

图1 葡萄糖标准曲线

1.6 FPase 酶活力的检测

将透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株FIB-3 接种50 mL 滤纸酶活检测培养基，160 rpm、37℃摇床培养过夜获得种子培养液，按10%（v/v）接种量接种酶活检测培养基，160 rpm、37℃摇床发酵培养，每隔24 h 取发酵液，4℃、6000 rpm 离心10 min，取1 mL 上清加入到1 mL 0.2 mol/L pH 4.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液中，加入新华滤纸条（6×1 cm），待滤纸条混匀于液体后，50℃酶促反应30 min，以沸水灭活10 min 的发酵上清液为空白对照，取出后迅速进行DNS 法测定还原糖生成量，并计算FPase 酶活力。以每分钟每毫升发酵上清液酶促反应释放1 μg 葡萄糖的量为一个酶活单位（U）。实验重复三次。

1.7 菌株FIB-3 的鉴定

（1）形态学观察 将菌株FIB-3 划线、37℃培养，观察菌落形态并进行革兰氏染色，同时将该菌株进行电镜扫描观察。电镜扫描的步骤如下：取菌株FIB-3 菌苔于磷酸缓冲液中，离心、弃上清；加入电镜固定液，4℃固定3 h，离心、弃上清；磷酸缓冲液洗涤菌体5 min 两次，离心、弃上清；依次向菌体中加入10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%浓度的乙醇进行脱水，静置10 min，离心、弃上清；加入适量乙酸异戊脂溶液，静置30 min 进行干燥，离心、弃上清；用无菌接种环将菌体取出放在无菌的滤纸上，包好后自然风干，倒入干净无水的研钵中碾碎，用干燥的滤纸包好备用；用牙签蘸取少量碾碎的菌体轻轻地涂于扫描电镜样品台上，再经喷金处理后置于扫描电镜下观察。

（2）分子生物学分析 将菌株FIB-3 接种LB培养基，160 rpm、28℃摇床培养过夜，5 000 rpm、4℃离心10 min，弃上清液；TE 悬浮沉淀，加入10%的SDS 溶液、蛋白酶K，混匀，55℃水浴1 h；加入5 mol/L 的NaCl 溶液，混匀，加入CTAB/Na-Cl 溶液，混匀，65℃水浴20 min；加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）溶液，5 000 rpm、4℃离心10 min，取上清液，加入等体积的异丙醇溶液，混匀，室温静置10 min，5 000 rpm、4℃离心5 min；弃上清液，70%乙醇漂洗沉淀，5 000 rpm、4℃离心5 min，弃上清；空气中静置使乙醇挥发，加入TE 溶解沉淀，将DNA 基因组样品－20℃保存备用。提取的DNA 基因组以通用引物进行PCR 扩增[10]，将PCR 反应产物进行纯化，由上海生工生物工程有限公司进行序列测定，利用BLASTN 软件和MEGA 6.0 软件进行比对和分析，NJ 法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

从酒糟泥图样中初步筛选出4 株长势较好的菌株，分别命名为FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4。

将4 株菌FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4 点种于CMC-Na 平板后倒置培养2 d，经刚果红染色发现FIB-3 透明圈最明显，透明圈直径与菌落直径比值为1.88±0.175。

图2 菌株FIB-3 产生的透明圈

2.2 菌株FIB-3 滤纸酶活的测定

菌株FIB-3 接种滤纸酶活检测培养基，摇床发酵培养，每隔24 h 取样、离心取上清进行酶促反应，DNS 法根据标准曲线测定还原糖生成量，计算FPase 酶活力。6 d 中菌株FIB-3 的滤纸酶活先随着时间的增加而增加，到第5 d 增至最高（8.436 U/mL），随后降低（图3）。

图3 菌株FIB-3 滤纸酶活力的测定

2.3 菌株FIB-3 的鉴定

菌株FIB-3 菌落呈乳白色，光滑圆球状，表面湿润粘稠（图4-A），菌体杆状（图4-B），革兰氏染色呈阳性。

图4 菌株FIB-3 菌落形态（A）及电镜扫描图（B）

将菌株FIB-3 提取的基因组进行PCR 扩增，BLASTN 比对分析上海生工所测序列。结果显示菌株FIB-3 为芽孢杆菌（Bacillus sp.），在系统发育树中与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CBMB205 聚在一起（图5）。因此，菌株FIB-3 初步确定为一株贝莱斯芽孢杆菌。

图5 基于16S rDNA 序列构建的系统发育树

3 结论与讨论

纤维素酶由内切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（FPase）和β-葡萄糖苷酶组成的复合酶[11]，可以将纤维素降解为葡萄糖。虽然可以从网翅目、直翅目、鞘翅目等昆虫体内的消化液中发现纤维素酶[12]，但纤维素酶主要来源于微生物。细菌[7,8]、放线菌[13]、酵母菌[14]和霉菌[4]都可以产生纤维素酶，其中还有部分不可培养微生物也可以产生纤维素酶[15]。

本文利用羧甲基纤维素钠培养基从酒糟泥中初步筛选出4 株（FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4）具有纤维素降解能力的菌株，经刚果红染色复筛时菌株FIB-3 透明圈直径与菌落直径比值（1.88±0.175）最大；DNS 法测出该菌株在第5 d 时滤纸酶活达到最高（8.436 U/mL）；根据形态学观察和分子生物学分析，初步确定菌株FIB-3 为一株贝莱斯芽孢杆菌。

贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，最早于1999 年分离自西班牙一条名为贝莱斯河流(Vélez)的河口，却在2005 年才被首次报道[16]。贝莱斯芽孢杆菌能够产生细菌素、抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等多种抗菌物质，还可以产生赤霉素、吲哚乙酸等植物激素，具有广谱的抑菌和促生作用，在动植物病害的生物防治方面被广泛应用[17,18]。

目前，对贝莱斯芽孢杆菌具有纤维素降解活性的报道较少。2019 年陈龙等对一株杜仲树皮内生菌贝莱斯芽孢杆菌的内切纤维素酶进行产酶条件优化及酶学性质分析[19]，但没有对其滤纸酶活进行研究。本文仅对菌株FIB-3 的滤纸酶活进行测定，没有做CMCase 酶活。在后期的研究中，我们将对菌株FIB-3 的CMCase 酶活、这两种酶的性质以及该菌株的生防功能进行进一步分析。

4 小结

本文利用羧甲基纤维素钠培养基从酒糟泥中初步筛选出4 株具有纤维素降解能力的菌株，其中菌株FIB-3 刚果红染色时透明圈直径与菌落直径比值最大，并且该菌株在第5 d 时滤纸酶活达到最高；结合形态学观察和分子生物学分析，初步确定菌株FIB-3 为一株贝莱斯芽孢杆菌。