零价铁强化生物硝化效能及机理研究

2021-10-31陈红谢静成钰莹于鑫陈善平薛罡王美琳罗意贺向宇

化工学报 2021年10期

陈红，谢静，成钰莹，于鑫，陈善平，薛罡，王美琳，罗意，贺向宇

（1东华大学环境科学与工程学院，上海 201620；2上海环境卫生工程设计院有限公司，上海 200232）

引言

随着科技的发展，新型药剂与材料的开发使用极大提高了人民生活水平，但同时也增加了新型污染物暴露的环境风险。三氯生（TCS），化学名称为“5-氯-2-（2，4-二氯苯氧基）苯酚”，由于具有广谱抗菌性[1]，被作为消毒剂或者防腐剂，广泛应用于临床和各类消费品中。但是，TCS也被证明具有生态毒性，还会影响生物体内酶的活力，甚至可以直接损害DNA造成基因毒性[2]。纳米颗粒（NPs）由于具有独特的物理化学性质，被应用于社会、经济和工业各领域，随着NPs使用量大幅增长，释放到环境中的NPs也随之增加，并且在环境中不断积累[3]。在水生介质中，NPs会生成活性氧（ROS），或溶出金属离子，从而对生物造成毒害影响[3]。

脱氮是污水处理过程中的一项重要环节，目前污水处理厂仍普遍采用硝化反硝化生物脱氮工艺。其中，将氨氮氧化为硝氮的硝化作用作为脱氮过程的第一步，对总氮的去除具有重要作用[4]，然而主要负责硝化过程的自养型硝化菌容易受到有毒有害物质的干扰[4]。由于TCS和NPs在人类生产生活的广泛使用，伴随使用过程的物质释放，使其不可避免地进入到污水处理系统中[5-6]，从而影响脱氮处理效果。已有研究发现，在SBR系统中，1 mg·L-1的TCS能够抑制硝化作用[7]；1 mg·L-1的CuNPs的长期暴露会大幅降低亚硝化阶段的氨氮去除率[6]。此外，由于多种新型污染物可能同时存在于污水管道系统中并且发生交互作用[8]，其对污水生物处理效能的复合影响有别于单独影响，研究发现，0.5 mg·L-1的TCS、10 mg·L-1的CuNPs分别导致硝化效率下降8.7%、34%，而其复合影响使硝化效率下降31.7%[4]。因此，有必要探究如何改善或强化受抑制的生物硝化效果。

零价铁具有廉价、低毒且不产生二次污染等特点，越来越广泛地应用于水污染处理中。添加适量的铁可以增强酶的活性，提高生物处理效率[9]，可通过投加零价铁提高脱氮除磷效率[10]。此外，铁的还原作用能够将多种有毒难降解物质，如偶氮类、硝基苯类、氯代物以及高价金属阳离子等，转化为低毒性、易降解的物质[11]，从而减轻对微生物的抑制作用。再者，铁元素是某些硝化酶（如亚硝酸盐氧化还原酶（NXR））的活性中心并且铁屑释放出来的Fe3+能够显著促进硝化酶(氨单加氧酶（AMO）、NXR)的活性[12]，基于此，铁屑可以提高好氧阶段的硝化效率[12-13]。因此，当生物硝化受到抑制时，通过零价铁强化具有理论可行性。

另一方面，TCS和铜制剂都具有类似抗生素的作用[1,14]。然而在污水生物处理过程中，若污泥微生物长期暴露在含有TCS、CuNPs的环境中，可能会导致耐药细菌的增加和抗性基因的富集。研究发现零价铁或亚铁离子可以增强微生物活性，并且改变微生物群落的组成[10,12,15]，而抗性基因的富集主要与微生物种类有关[16]。因此，铁的投加可能会改变抗性基因的富集规律。

本研究以TCS和广泛使用的纳米铜颗粒（CuNPs）作为目标新型污染物，考察投加零价铁对TCS、CuNPs单独暴露及复合暴露下受抑制的硝化作用的强化效果，并通过污染物浓度、硝化关键酶活力、硝化基因丰度和微生物群落结构探究强化机理。此外，以TCS耐药性mexB基因，CuNPs抗性基因copA为研究对象，考察零价铁投加后对抗性基因富集规律的影响。

1 材料与方法

1.1 主要药品与器材

纳米铜（CuNPs），分析纯，购于阿法埃莎（中国）化学有限公司；三氯生（TCS），分析纯，购于Dr.Ehrenstorfer公司。

磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司84-1A；高效液相色谱仪：Thermo公司U3000；电感耦合等离子光谱发生仪：Agilent公司720ES；冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司LGJ-10E；固相萃取小柱：Supelco公司ENVI-18；氮吹仪：天津市恒奥科技发展有限公司HSC-12A。

1.2 实验设计

活性污泥来源于上海松江污水厂的二沉池回流污泥，取回的新鲜污泥静置24 h，排出上清液，浓缩污泥与实验配水混合，使泥水混合液的MLSS=2500~3000 mg·L-1。配水组成参考文献[4]，使配水中的COD、NH4+-N和溶解性正磷酸盐（SOP）的浓度分别为350 mg·L-1、30 mg·L-1和2 mg·L-1，控制配水pH在7.5左右。

实验设计两组反应器，反应器设置及运行参数参考文献[4]，第一组反应器为不添加零价铁的Sludge组，包含4个反应器，分别是只加入活性污泥和实验配水的Control组，在空白对照的基础上添加0.5 mg·L-1TCS的TCS组，另添加了10 mg·L-1CuNPs的CuNPs组，以及同时添加了0.5 mg·L-1TCS和10 mg·L-1CuNPs的TCS+CuNPs组。第二组反应器在第一组的基础上添加30 g·L-1的零价铁，其他的反应条件均保持一致，并记为Sludge-Fe组，亦包括4个反应器，分别记为Control+Fe组、TCS+Fe组、CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组。本实验中使用的零价铁为铁刨花。

新鲜污泥经驯化脱氮效率稳定在90%以上，再进行后续污染物暴露及零价铁强化实验。

1.3 TCS的测定

泥相中TCS测定需要将污泥先冷冻干燥，研磨过筛，然后称取0.1 g污泥于20 ml乙酸乙酯中进行超声萃取，超声参数为：功率100%，水温50℃，时间20 min。超声完毕后，在8000 r·min-1下离心5 min，取上层有机溶液，剩下的混合液继续超声，如此重复3次。收集到的有机溶液经氮吹至5 ml左右，用蒸馏水定容至100 ml，并调节pH在2~3，经0.22μm的滤膜过滤后，利用高效液相色谱（HPLC）进行测量，色谱条件参考文献[7]。测量水相中的TCS时，先利用固相萃取装置对水样进行富集，水样以5 ml·min-1的流速缓慢流经小柱，用6 ml的5%的甲醇水溶液（5∶95，体积比）淋洗，真空干燥20 min，最后用3 ml乙酸乙酯洗脱3次。收集洗脱液于玻璃容器中，氮吹近干后，用乙腈定容至1 ml。经0.22μm的滤膜过滤后，利用高效液相色谱（HPLC）进行测量。

1.4 酶活力的测定

取50 ml泥水混合液，在4℃条件下，5000 r·min-1离心5 min后去掉上清液，用磷酸缓冲溶液（0.1 mol·L-1PBS，pH=7.4）清洗污泥，再离心去除上清液，重复清洗3次。将清洗完的污泥重悬于30 ml的磷酸缓冲溶液中，在冰水浴的条件下超声破碎（20 kHz，5 min），然后在4℃条件下，12000 r·min-1离心15 min，上清液为粗酶提取液。

氨单加氧酶（AMO酶)的测定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含2 mmol·L-1(NH4)2SO4的0.01 mol·L-1PBS，30℃振荡30 min，然后测量-N的浓度。

亚硝酸盐氧化还原酶（NXR酶）的测定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含1 mmol·L-1NaNO2的0.01 mol·L-1PBS，30℃振荡30 min，然后测量-N的浓度。测定中需设置空白对照，即用蒸馏水代替粗酶，其他操作相同，然后测量-N的浓度。最后，空白中的-N浓度减去样品中的-N浓度，即为酶催化过程中消耗的-N浓度。

测定粗酶提取液中的蛋白质浓度，测定方法采用福林-酚试剂法[17]。AMO酶及NXR酶活力的计算公式为，其中，为反应体系中-N的物质的量的变化,μmol,测定AMO酶时为-N的增加量，测定NXR酶为NO-2-N的下降量；t为反应时间，min；mp为反应体系中蛋白质的质量，mg。

1.5 其他指标的测定

2 结果与讨论

2.1 铁促进污泥硝化作用

图1(a)表示一个反应周期内的氨氮浓度随时间的变化情况。空白组的硝化速率在前2 h内最大，然后缓慢降低，最后在6~10 h内氨氮浓度趋于稳定，并且最终的硝化效率达到96.4%。相比于空白组，TCS组、CuNPs组以及复合组的硝化作用均受到不同程度的抑制。TCS组、CuNPs组以及复合组在2 h时的硝化效率相近，均在35%左右，且明显低于空白组的，但是，2~10 h内，CuNPs组的硝化效率明显高于TCS组和复合组，而后两组的硝化效率近乎一致。一个周期反应结束后，TCS组、CuNPs组以及复合组的硝化效率分别为75.2%、85.6%和74.9%，明显低于空白组的96.4%。

有文献报道，零价铁能够促进生物脱氮作用[10-11]，所以在以上4组反应的基础上引入零价铁，在TCS、CuNPs单独作用及复合作用的短期暴露下，研究零价铁对污泥硝化作用的影响。在图1(a)中，加铁组均用虚线表示。在引入零价铁之后，4组反应器中的硝化效率表现为：Control+Fe组>CuNPs+Fe组>TCS+CuNPs+Fe组>TCS+Fe组，这表明，即便有零价铁的加入，TCS、CuNPs以及二者的复合还是会抑制污泥的硝化作用，且抑制程度与之前相似。但是，零价铁的加入会改善污泥的硝化作用，10 h时，Control+Fe组、TCS+Fe组、CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组的硝化效率分别为96.9%、78.8%、88.9%和81.6%，与未加入零价铁时相比，系统中的硝化效率分别提高了0.5%、3.6%、3.3%和6.7%。因此，在TCS、CuNPs短期暴露的条件下，加入零价铁能够小幅度地改善污泥的硝化效果，并且对于TCS+CuNPs组的改善程度最高。

图1 污染物短期暴露时(a)、长期暴露时(b)的氨氮浓度以及长期暴露时硝态氮浓度(c)随时间的变化（长期暴露中无铁投加组的数据引自文献[4]）Fig.1 The change of ammonia nitrogen concentration with time when short-term exposure(a)and long-term exposure(b)to pollutants and changes of nitrate nitrogen concentration with time under long-term exposure of pollutants(c)(The data in Fig.(b)when long-term exposure without adding iron were quoted from Ref.[4])

短期暴露条件下引入零价铁，可以轻微改善污泥的硝化效果，然而在污染物的长期暴露下，引入零价铁会对系统产生怎样的影响？因此，在连续运行的反应器中，从第1天起每隔3天取样，测定反应结束时的出水氨氮浓度，结果如图1(b)所示。根据成钰莹等[4]的研究可知，在TCS、CuNPs的长期暴露过程中，初期会对活性污泥的硝化效果产生不同程度的抑制作用，但随着时间的推迟，抑制作用会缓慢减弱，同时系统的硝化作用会逐渐恢复至正常。

在投加了零价铁的4组反应器中，TCS、CuNPs对污泥硝化作用的抑制依然存在，但是，在反应器运行的初期，零价铁的投加减轻了目标污染物的抑制作用，例如，在第4天，TCS+Fe组、CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组的硝化效率分别达到99.8%、76.8%和85.6%，相比于未投加零价铁时的95.8%、73.9%和81.1%，三组的硝化效果均有一定程度的改善；此外，污染物长期暴露下，投加零价铁可在更短时间内恢复硝化效果，如TCS组的硝化效率需在反应第13天时方可达到Control组的硝化效果，而TCS+Fe组在第4天即可恢复硝化效能至空白反应器水平。因此，在污染物长期暴露下，投加零价铁有利于硝化效率的提高与恢复。

2.2 零价铁对污染物浓度的影响

经长期运行，系统稳定之后，在投加零价铁和不加零价铁的两种情况下，分别测定CuNPs组和复合组中的Cu2+的赋存情况，结果如图2(a)所示。相比于泥相中的铜离子含量，水相中的含量可以忽略不计，说明进入系统中的铜离子被污泥吸附并在泥相中累积。在不含零价铁的CuNPs组和TCS+CuNPs组分别测定出115.5 mg·L-1和106.5 mg·L-1的铜离子，当投加零价铁之后，CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组的铜离子含量分别为80.6 mg·L-1和69.8 mg·L-1，分别减少了34.9 mg·L-1和36.7 mg·L-1的铜离子。这可能是由于零价铁的强还原性导致CuNPs溶出的铜离子与零价铁发生了置换反应[11]：，降低了系统中的铜离子浓度，削减了CuNPs的毒性，同时该反应还可促进零价铁向亚铁离子和铁离子的转化，有利于改善污泥性能，从而提高污泥的硝化能力。此外，无论是否加入零价铁，TCS的存在使系统中的铜离子含量略有降低。

图2 Cu2+(a)、TCS(b)在泥相和水相中浓度Fig.2 Concentrations of Cu2+(a)and TCS(b)in sludge and liquid phases

在研究铜离子赋存情况的同时，也研究了TCS在系统中的含量以及分布情况。经长期运行后，各反应器中泥相和水相中TCS的含量如图2(b)所示。在长期运行过程中，部分TCS无法被降解，会在系统中积累。在投加零价铁之后，TCS+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组中的TCS浓度分别为147.4μg·L-1和166.4μg·L-1，相比于未投加零价铁的TCS组（151.2 μg·L-1）和TCS+CuNPs组（189.8μg·L-1），分别减少了3.8μg·L-1和23.4μg·L-1，说明零价铁的引入可以提高TCS的降解率，削弱毒性，进而改善污泥的硝化作用。系统中TCS在泥相中的含量是107.5~119.2 μg·L-1，在水相中的含量是39.9~72.8μg·L-1，泥相中的TCS含量远高于水相。与TCS组相比，TCS+CuNPs组中的TCS浓度明显增多，在泥相和水相中分别增加了5.8%和79.2%，说明CuNPs的存在会降低微生物对TCS的降解能力，促进TCS的富集，并且大幅提高TCS在水相中的含量。与TCS+CuNPs组相比，TCS+CuNPs+Fe组中TCS浓度明显下降，此外，水相中的TCS浓度下降了34.0%，而泥相中无显著差别，表明零价铁能够在促进TCS降解的同时，削弱CuNPs的影响，明显降低TCS在水相中的含量。

2.3 反应器中铁的存在形态

为了分析污泥中铁的形态，从Control组和Control+Fe组的反应器中取出活性污泥进行XPS检测，结果如图3(a)、(b)所示。相比于空白组，加入零价铁的反应器中出现了FePO4的峰(712.8 eV)，此外，Fe2O3(710.8 eV)和Fe(OH)O(711.8 eV)的射线强度也显著增加，这表明零价铁的引入增加了Fe3+的含量。在反应器内加入铁刨花会产生生物腐蚀，并且处在曝气状态下，因此会不断产生Fe3+，并最终沉积于污泥中。

进一步测量Sludge-Fe组四个反应器中Fe3+浓度，结果如图3(c)所示。由图可知，Control+Fe组、TCS+Fe组、CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组中Fe3+浓度都很高，分别为207.0、185.6、346.4和297.1 mg·L-1。水相中Fe3+浓度极低，所有的Fe3+几乎全部沉积在污泥中。此外，含有CuNPs的两组反应器中含有更高的Fe3+浓度，可能是由于Cu2+的置换，这与2.2节中的分析一致。

图3 Control组(a)和Control+Fe组(b)活性污泥中Fe的XPS谱图以及Sludge-Fe组四个反应器中Fe3+浓度(c)Fig.3 XPS spectra of Fe in activated sludge in the Control group(a)and Control+Fe group(b)and the Fe3+concentration in the four reactors in the Sludge-Fe group(c)

2.4 铁对关键酶活性的影响

在之前的研究中证实了零价铁对含氮化合物的影响不是直接通过物化反应，而是通过影响微生物从而间接影响氮素的转化[12]。因此，接下来研究零价铁对微生物活性与结构的影响。氨单加氧酶（AMO酶)是在氨氧化过程中，将有机氮或者氨氮氧化成羟胺（NH2OH）的关键酶。在羟胺被氧化成亚硝酸盐之后，硝化菌利用亚硝酸盐氧化还原酶（NXR酶）将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，完成硝化过程。硝化酶的活力是表征硝化能力强弱的一种指标，通过测定AMO酶和NXR酶的酶活性来解释TCS、CuNPs对污泥硝化作用的影响。

图4(a)表示所有反应器中AMO酶的酶活性，Sludge组代表未添加零价铁的反应器，而Sludge-Fe组代表投加了零价铁的反应器。以未添加零价铁的Control组的酶活力为100%，则TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组的酶活力分别为44.7%、11.7%和39.2%，Sludge组的酶活性强弱表现为Control组>TCS组>TCS+CuNPs组>CuNPs组。在引入零价铁之后，4组反应器中AMO酶的酶活性均有明显提高，Control组、TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组的酶活性分别是未添加零价铁系统的1.3倍、1.5倍、2.8倍和1.4倍。

图4 各反应器中AMO酶活力(a)，NXR酶活力(b)和amoA基因丰度(c)Fig.4 AMO enzyme activity(a),NXR enzyme activity(b)and amoA gene abundance(c)in each reactor

图4(b)表示各反应器中NXR酶的酶活性。NXR酶的酶活性规律与AMO酶相似。在Sludge组的酶活性强弱也表现为Control组>TCS组>TCS+CuNPs组>CuNPs组。零价铁的添加同样提高了NXR酶的酶活性，Control组、TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组的酶活性分别是未添加零价铁系统的1.1倍、1.2倍、1.2倍和1.2倍。

相比于NXR酶，AMO酶的酶活力提高程度更显著，因此进一步对AMO酶的关键基因丰度进行测定，结果如图4(c)所示。本研究中使用2-ΔΔCt值来表达基因丰度，非绝对量。在未添加零价铁的Control组、TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组中含有的基因丰度分别为1.00、0.35、0.01和0.06，表明在TCS及CuNPs的暴露下，amoA基因的丰度明显下降，且丰度大小表现为Control组>TCS组>TCS+CuNPs组>CuNPs组。在加入了零价铁的系统中，Control组、TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组的amoA基因的丰度分别是1.17、0.40、0.05和0.10，与未添加零价铁的系统相比较，引入零价铁可以提高硝化功能基因amoA的丰度，进而提高污泥的硝化能力。

综上可知，在投加零价铁之后，AMO酶和NXR酶这两种硝化关键酶的酶活性均显著提高，且AMO酶关键基因的表达丰度在投加零价铁后提高，从而改善了污泥的硝化能力。

2.5 铁对抗性基因的影响

TCS作为一种广谱杀菌剂被广泛利用，其对细菌的暴露可能导致对TCS的抗药性。本文选择了涉及TCS耐药性的mexB基因进行研究，图5(a)表示各反应器中mexB基因的丰度变化（使用2-ΔΔCt值来表达基因丰度，非绝对量）。在未添加零价铁的Sludge组中，TCS组和TCS+CuNPs组中的mexB基因的丰度均大于Control组，这说明TCS的暴露增加了mexB基因的丰度，另外，TCS+CuNPs组中的mexB基因的丰度大于TCS组，这可能是由于CuNPs的存在给细菌带来了选择性压力并且促进了mexB基因的传播[18]。引入零价铁之后，Control组和TCS+CuNPs组的mexB基因的丰度增大，而TCS组的基因丰度却明显下降，这可能与mexB基因的宿主细菌的丰度变化有关。

过量的铜会对细胞造成损害，细菌为维持胞内稳态进化形成了抗铜机制，其中copA基因便是一种典型的铜抗性基因[14]。图5(b)表示各反应器中copA基因的丰度变化（使用2-ΔΔCt值来表达基因丰度，非绝对量）。在未添加零价铁的Sludge组中，Control组、CuNPs组和TCS+CuNPs组中copA基因的丰度分别为1、1.04和1.03，没有产生明显差别。但是，在投加了零价铁的系统中，除了Control组，CuNPs组和TCS+CuNPs组的copA基因的丰度均显著提高，分别为1.34和1.77，这可能是由于置换反应促进了更多铁离子的生成，使得系统中微生物胞外电子传递活动更加频繁[10]，从而促进了基因的水平转移。

图5 各反应器中相关抗性基因的丰度Fig.5 Abundance of related resistance genes in each reactor

综上所述，TCS和CuNPs这两种污染物同时存在时会提高相关抗性基因的丰度，而在此基础上引入零价铁会进一步提升基因丰度，增加抗性基因的潜在环境风险。

2.6 零价铁对微生物结构的影响

2.6.1 零价铁对门水平微生物结构的影响污泥硝化作用的核心理论是不同功能的菌种逐步完成相关反应使得水中的氨氮得以去除，所以微生物的群落结构对污泥的硝化功能起着决定性作用。图6表示在门水平上，各反应器的群落结构组成。在未添加零价铁的Sludge组[图6(a)]中，Control组中占据绝对优势的是Proteobacteria，在很多污水处理工艺中，Proteobacteria都占主导地位[18]，它们可以负责氨氮的去除和亚硝态氮的积累[18]，还包含了很多好氧反硝化菌。除了Proteobacteria，另外三种优势菌是Planctomycetes、Bacteroidetes和Nitrospirae，分别占有12.6%、9.8%和3.7%。Bacteroidetes能够进行反硝化作用[19]，而Nitrospirae具有将亚硝酸盐转化为硝酸盐的功能[18]，因此，Control组中具有优良的氨氮去除能力。TCS组与Control组没有较大的差异。在CuNPs组中，除了Proteobacteria和Bacteroidetes，优势菌群还有Gemmatimonadetes，丰度分别为53.5%、13.7%和19.2%。在TCS+CuNPs组中，优势菌依次为Proteobacteria、Bacteroidetes和Gemmatimonadetes，分别占有86.6%、7%和5.9%。由于Planctomycetes和Nitrospirae丰度的明显减少，所以CuNPs组和TCS+CuNPs组中的硝化效果不够理想。

相较于Sludge组，在添加了零价铁的Sludge-Fe组[图6(b)]中，多出了Actinobacteria和Acidobacteria两种优势菌门。Acidobacteria被证明在铁的氧化还原反应中发挥重要作用，且被检测到在富含铁矿的环境中占据主导优势[20]；Actinobacteria能够产生铁载体，促进微生物对铁的吸收[21]，因此零价铁的加入引起这两种菌门的微生物丰度大幅增加。此外，铁刨花中含有零价铁、碳以及其他金属，可以在废水中形成微尺度原电池，因此会促进电化学活性微生物（如Proteobacteria、Actinobacteria和Acidobacteria）的电子传递。和Sludge组相比，零价铁的引入增加了Control组和TCS组中Nitrospirae的相对丰度，也明显增加了Sludge-Fe组中Bacteroidetes的占比，特别在CuNPs组和TCS+CuNPs组中，Bacteroidetes的占比由原先的13.7%、7%分别增长到22.6%、20.7%，这说明了零价铁的添加不仅可促进硝化作用，还可能促进反硝化作用，具有脱氮功能，与Chen等[12,15]研究结果一致。

图6 Sludge组(a)和Sludge-Fe组(b)微生物群落结构的差异（门水平）Fig.6 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(phylum level)

微生物种群结构除了影响生物脱氮，还与系统中抗性基因的富集有关。研究表明，Proteobacteria是TCS抗性基因mexB的微生物载体[22]，在未添加零价铁的Sludge组中，Proteobacteria的相对丰度表现为TCS+CuNPs组（86.6%）>TCS组（66.4%）>Control组（63.7%），这与mexB基因的丰度变化规律一致。在加入零价铁后，各组中Proteobacteria的相对丰度均有明显下降，宿主细菌丰度的下降导致了TCS+Fe组中mexB基因丰度明显小于TCS组。然而，在潜在宿主细菌丰度下降时，TCS+CuNPs+Fe组和Control+Fe组中mexB基因丰度明显增加，这可能是由于Proteobacteria中mexB某些宿主微生物丰度增加导致。

在图6的几种优势菌门中，铜抗性基因copA的微生物宿主主要有Proteobacteria和Actinobacteria[23-24]。在未添加零价铁的系统中，Proteobacteria的相对丰度表现为TCS+CuNPs组（86.6%）>Control组（63.7%）>CuNPs组（53.5%），然而copA基因丰度在三组中没有明显差别，表明Proteobacteria中涉及丰富的菌属，不能对copA基因丰度起决定性作用。添加零价铁之后，Control+Fe组中Proteobacteria的相对丰度明显降低，从63.7%减小到58%，但是零价铁的引入增加了新的优势菌门——Actinobacteria，Proteobacteria的降低与Actinobacteria的增加，最终导致Control组中copA基因丰度的改变不显著。在CuNPs组中，零价铁的添加使得Proteobacteria的相对丰度明显提高，同时还引入了新的copA基因宿主Actinobacteria，copA基因丰度因此明显提高。在复合组中，零价铁使得copA基因丰度显著提升，但是copA基因宿主Proteobacteria的占比从86.6%减小到76.8%，这可能是由于零价铁促进了copA基因的水平传播[25]。综上，宿主细菌的丰度能够在一定程度上引起两种抗性基因丰度的变化。

2.6.2 零价铁对属水平微生物结构的影响图7(a)表示在不添加零价铁时，各反应器微生物群落在属水平上的差异。TCS组的群落结构与Control组相差不大，在Control组和TCS组中占比最大的是UnclassifiedMethylophilaceae，分别占有28.1%和28.6%，然而在CuNPs组和TCS+CuNPs组中，UnclassifiedMethylophilaceae的占比减少至2.9%和2.3%。据报道，Methylophilaceae具有反硝化功能[26]。在Control组中，Rhodobacter的占比近乎为0，然而在CuNPs组和TCS+CuNPs组中，Rhodobacter的占比最大，分别为24.3%和29.1%，Rhodobacter也是一种反硝化菌[27]。CuNPs的存在促进了Gemmatimonas，Methylotenera和Dechloromonas的增长，这三种菌属都具有反硝化功能[27]。

图7 Sludge组(a)和Sludge-Fe组(b)微生物群落结构的差异（属水平）Fig.7 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(genus level)

Nitrospira是一种硝化细菌属，甚至具有完全硝化的能力[28]，在Control组、TCS组、CuNPs组和TCS+CuNPs组中的相对丰度分别为3.7%、2.3%、0.6%和0.2%，TCS、CuNPs的暴露减少了硝化菌的相对丰度，导致污泥硝化能力被抑制。

图7(b)表示投加了零价铁之后，各反应器中微生物群落结构的差异。在TCS+CuNPs+Fe组中，由于零价铁的添加，占比最大的菌属从Rhodobacter变成了UnclassifiedMethylophilaceae，而其他三组的最大优势菌属没有改变。零价铁的引入明显增加了Nitrospira在Control+Fe组和TCS+Fe组中的相对丰度，然而在CuNPs+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组中未发现Nitrospira的明显增长。在零价铁的引入后，系统中出现了两种新的优势菌属——Lacibacter和Flavobacterium，Flavobacterium属于反硝化菌[5]，Lacibacter属于Chitinophagaceae，此菌科为异养氨氧化细菌[29]。此外，零价铁的引入还带了Dechloromonas的增长，尤其是在单独加入CuNPs组中，由原来的7.3%变成了20.2%，Dechloromonas可以利用硝酸盐作为电子供体实现Fe（Ⅱ）的氧化[30]。而对于Methylotenera，零价铁的引入促进了其在Control+Fe组、TCS+Fe组和TCS+CuNPs+Fe组中的增长。零价铁的引入能够促进Nitrospira和Lacibacter等硝化细菌的增长，改善污泥的硝化性能。此外，零价铁还提高了Flavobacterium，Dechloromonas和Methylotenera等反硝化细菌的丰度，提高了污泥的反硝化能力。

除了影响脱氮性能，微生物群落的演替也会改变抗性基因的丰度，因此进一步探究本系统中优势微生物与抗性基因的关系。相关研究发现，Rhodobacter细菌是copA基因的宿主[31]。未添加零价铁时，在Control组、CuNPs组和TCS+CuNPs组中，Rhodobacter分别占比0%、24.3%和29.1%，Control组中Rhodobacter的相对丰度远小于其他两组中，但是三组中copA基因的丰度却没有明显差别。在系统中引入零价铁之后，Rhodobacter在Control+Fe组和CuNPs+Fe组中的占比均略有提高，然而，在TCS+CuNPs+Fe组中占比明显减少，从29.1%减少到13.3%。除了空白组之外，零价铁的添加导致了另外两组中copA基因丰度的提升，特别是复合组中，从1.03增加到1.77。综上的现象表明Rhodobacter的相对丰度和copA基因丰度并没有高度相关性，这可能表明系统中存在着其他copA基因的宿主细菌；此外，对于mexB基因，还没有相关文献证明在图7的优势属中属于mexB基因的宿主细菌，因此，可能存在其他mexB宿主细菌，这有待进一步的深入研究。