不同添加剂对构树青贮饲料发酵品质和蛋白质降解的影响

2021-10-30吴长荣代胜梁龙飞孙文涛彭超陈超郝俊

草业学报 2021年10期

吴长荣，代胜，梁龙飞，孙文涛，彭超，陈超，郝俊

（贵州大学动物科学学院草业科学系，贵州贵阳550025）

构树（Broussonetia papyrifera）为桑科植物，叶蛋白含量超过20%，富含氨基酸、维生素、矿质元素及微量元素等［1］。在当前畜牧业发展迅速，蛋白饲料和粗饲料相对短缺的背景下，将其发展为优质的木本饲料资源，对畜牧业发展具有重要意义。构树纤维含量较高，直接饲喂影响家畜适口性，而且蛋白质消化率低，通过青贮发酵能适度降低纤维，增加饲喂价值［2-3］。宋博等［4］研究发现在育肥猪低蛋白水平饲粮中添加10%构树全株发酵饲料可提高肌肉中肌内脂肪和游离氨基酸含量，改善猪肉品质。王永树等［5］通过构树叶畜禽喂养对比试验，发现畜禽增效达46%～108%，司丙文等［6］在饲粮中添加杂交构树青贮发现构树青贮提高了肉羊的生长性能、免疫力和抗氧化能力，促进肉羊健康，同时提高了肉羊背最长肌中n-3PUFA 含量，改善了羊肉脂肪酸的构成。

然而，直接青贮对纤维的降解程度非常有限，而且构树缓冲力高、含糖量低，直接青贮不利于乳酸菌发酵，往往容易导致青贮失败［7］。梁春宇等［8］的研究表明，泌乳前期奶牛饲粮中添加超过14%的构树青贮料后会导致奶牛产奶量和养分表观消化率降低。另外青贮过程难免有蛋白质降解为非蛋白蛋（non-protein nitrogen，NPN）和一些含氮化合物，蛋白质的大幅度分解成为影响青贮材料营养价值和利用价值的一个重要因素［9］。此外，由于NPN 不能被家畜有效的利用，导致过多的被排出体外，还会引起更多的环境污染问题［10］。柯文灿［11］研究发现，紫花苜蓿（Medicago sativa）添加由乳酸和无机酸组成的复合添加剂青贮后，NPN 的含量较对照组显著降低。崔鑫［12］通过研究紫花苜蓿添加甲酸青贮发现，添加甲酸能更好地保存紫花苜蓿青贮料中的肽氮，Sophie 等［10］的研究发现，添加剂对在青贮中氮组分降解有明显的抑制作用，添加单宁提取物青贮后减少了10%的NH3-N 降解。然而，目前有关添加剂对构树青贮发酵的影响，尤其是作为蛋白饲料而言构树青贮中氮组分含量变化的研究报道较少。

因此，本研究以晾晒1.5 h 的杂交构树为青贮原料，添加糖蜜后再添加纤维素酶、乳酸菌、甲酸、丙酸等添加剂，研究不同添加剂对构树青贮饲料营养价值、发酵品质、酶活性和蛋白质降解的影响，从而为构树青贮饲料的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料准备

原材料为新鲜的杂交构树，取于贵州省长顺县构树组培基地（2019年6月14日），截取构树嫩枝叶（距顶端60 cm 处）后晾晒1.5 h（温度：25 ℃，光照：34.3×103lx），再用铡草机将其切碎为1.5～2.5 cm 左右备用。

添加剂：糖蜜（含糖量约为48%），甲酸（HCOOH，分析纯，纯度≥88%），纤维素酶（主要成分为纤维素酶，酶活力≥30000 U·g-1），乳酸菌［主要成分为植物乳杆菌（Laobacillus plantarum），活菌数≥1.0×1010cfu·g-1］。构树原料营养成分如下（表1）。

表1 构树原料营养成分Table 1 Nutritional components of paper mulberry silage

1.2 试验设计

共设置4 个处理组，原料中添加4%糖蜜作为对照，记作CK 组；在添加糖蜜的基础上分别添加1 g·kg-1纤维素酶、0.02 g·kg-1乳酸菌、4 mL·kg-1甲酸，分别记作CE、LB 和FA 组，每个处理设置3 个重复。在青贮0、1、3、7、15、30、45 d 分别取样测定青贮料氮组分，并在青贮45 d 后弃用上层，取袋中间位置的样品混匀用于分析青贮料营养和发酵品质。

1.3 试验指标及测定

取青贮完成后样品10 g，加入90 mL 蒸馏水，搅拌均匀，4 ℃条件下浸提24 h 后再用4 层纱布和定性滤纸过滤，滤液即为样品的浸提液，用于营养成分、发酵品质、氮组分和酶活性测定。干物质（dry matter，DM）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗纤维（crude fiber，CF）、粗灰分（crude ash，Ash）、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量参照张丽英［13］的方法测定；可溶性碳水化合物（watersoluble carbohydrate，WSC）参考Wang 等［14］的方法测定；pH 值用PHS-3C 酸度计（上海精密仪器有限公司）测定；乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）的含量测定参照高海娟等［15］的方法；非蛋白氮（non-protein Nitrogen，NPN）含量用微量凯氏定氮法测定［16］；游离氨基酸（free amino acids，AA-N）含量采用茚三酮-硫酸肼比色法测定［17］；氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定［18］；肽氮（peptide nitrogen，peptide-N）含量按照公式：Peptide-N=NPN-（AA-N+NH3-N）计算得出。总氮（total nitrogen，TN）含量即为粗蛋白含量除以6.25。羧基肽酶、酸性蛋白酶和氨基肽酶活性测定参考杨智明等［19］的方法。

1.4 数据处理

采用Excel 2013 软件对基础数据进行分析整理和图形绘制，采用SPSS 20.0 进行单因素（one-way ANOVA）和双因素方差分析，并用Duncan 法对各组进行多重比较，P＜0.05 为差异显著。并对青贮处理45 d 的指标参照王亚芳等［20］模糊隶属函数值法对3 种添加剂处理进行综合评价，如果测定的指标与青贮的营养价值呈正相关，计算公式如下：

如果为负相关，则用反隶属函数进行转换，计算公式如下：

式中：U为不同添加剂下的每个指标的隶属函数值，Xj表示第j个因子的得分值，Xmin表示第j个因子得分的最小值，Xmax表示第j个因子得分的最大值。将不同添加剂处理下的每个指标的隶属函数值相加后求平均值，即为隶属度。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对构树青贮饲料营养品质的影响

由表2可知，与CK 相比，3 种添加剂处理的DM 含量均增加，但只有FA 组差异显著（P＜0.05）；3 种添加剂处理的CP 含量显著增加（P＜0.05），CF 含量均显著降低（P＜0.05）；FA 和CE 处理的EE 含量显著增加（P＜0.05），LB 处理的EE 含量与CK 相比无显著差异；FA 和CE 处理的WSC 含量均增加，但只有FA 组差异显著（P＜0.05），LB 处理的WSC 含量显著降低（P＜0.05）；FA 与CE 处理的ADF 含量显著低于CK（P＜0.05）；CE 组NDF 含量显著低于其他各组（P＜0.05）。

表2 不同添加剂对构树青贮饲料营养品质的影响Table 2 Effects of different additives on nutrient quality of paper mulberry silage

2.2 不同添加剂对构树青贮饲料发酵品质的影响

与CK 相比，3 种添加剂处理的LA 和AA 含量均显著增加（P＜0.05），且LB 处理的LA 含量和FA 处理的AA含量达到最大值；3 种添加剂处理的pH 值、PA 含量和AN/TN 均显著降低（P＜0.05），其中LB 处理的pH 值、PA含量和AN/TN 均最低（表3）。

表3 不同添加剂对构树青贮饲料发酵品质的影响Table 3 Effects of different additives on fermentation quality of paper mulberry silage

2.3 不同添加剂对构树青贮饲料蛋白酶的动态影响

不同添加剂处理下构树青贮饲料酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶的动态变化如表4所示。随着青贮时间的延长，3 种酶活性总体均呈下降趋势，且每个时间段差异显著（P＜0.05）。0～45 d 内，LB、FA、CE 和CK 处理下酸性蛋白酶活性分别降低了80.60%、76.17%、71.06%和64.27%，羧基肽酶活性分别降低了69.67%、66.53%、59.17%和37.15%，而氨基肽酶活性在FA 和LB 处理下，到青贮第7 天就未检测到其活性，CE 与CK 组在青贮15 d 时失活。

表4 不同添加剂对构树青贮饲料蛋白酶的动态影响Table 4 Dynamic effects of different additives on the protease of paper mulberry silage

在同一青贮时间处理下，FA、LB 和CE 处理的酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶活性均显著低于CK 组（P＜0.05），CE 对3 种酶活性的影响小于FA 和LB（P＜0.05）。其中，LB 组酸性蛋白酶活性在各时间段均最低（3、7 d与FA 处理差异不显著）；0～3 d 内FA 组羧基肽酶活性降低了39.13%，之后缓慢降低，30 d 后其降低幅度小于LB组；FA 和LB 处理下第7 天氨基肽酶完全失活，而CE 和CK 在第15 天完全失活。

2.4 不同添加剂对构树青贮饲料氮组分的动态影响

不同添加剂处理构树青贮过程中pH 值、NPN、NH3-N、AA-N、peptide-N 和TN 含量动态变化如图1所示。pH 值在构树青贮过程中随着时间延长逐渐降低，青贮0～1 d，所有处理组均快速下降，其中FA 组显著低于其余各组（P＜0.05）。青贮15～45 d，除CK 组（4.29），各组pH 值均低于4.20。青贮后，CK 组每个时间点的pH 值均显著高于其余各处理组（P＜0.05）。青贮0～7 d 的FA 组pH 值最低，而青贮7～45 d 的LB 组pH 值最低且各处理组pH 值均变化较小。45 d 后CK 组pH 值显著高于其余各组（P＜0.05），但其余各组间差异不显著（图1a）。

NPN 含量在青贮0～1 d 生成较快，由18.34%迅速增加到30%以上，之后生成缓慢。不同青贮时间段中CK组的NPN 含量显著高于其余各组（P＜0.05），LB 组的NPN 含量最低，0～30 d 各组间差异不显著，30 d 后LB 组显著低于其余各组（P＜0.05）。45 d 的CK 组NPN 含量达到52.91%，而其余各处理组均低于50%，LB 组最低（46.87%），说明添加剂处理降低了NPN 的生成量（图1b）。

所有处理组NH3-N 含量随着青贮时间的延长逐渐增加，0～7 d 生成速率较快，之后趋于平稳。不同青贮时间段中CK 组的NH3-N 含量均显著高于其余各组（P＜0.05），LB 与FA 组间差异不显著，但显著低于CE 组（P＜0.05）。青贮0～30 d FA 与CE 组间差异不显著，之后CE 组显著高于FA 组（P＜0.05）。青贮45 d CK 组NH3-N含量（9.93%），显著高于其余各组（P＜0.05），LB 组最低（8.09%），但均低于10%，说明构树青贮生成的NH3-N较少，青贮效果较好，且添加剂对NH3-N 的生成具有抑制作用，其中乳酸菌抑制效果最好（图1c）。

AA-N 含量随时间延长逐渐增加，各处理组在0～3 d 生成速率较快，由3.73%迅速增加到20%以上，3～45 d较缓慢。不同青贮时间段中AA-N 含量表现为CK 组＞FA 组＞CE 组＞LB 组，CK 组生成量最多，FA 与CE 组间差异不显著，但都显著高于LB 组（P＜0.05）。青贮完成时CK 组达到39.38%，CE 组最低（34.01%）（图1d）。

Peptide-N 含量整体呈现为先增加后降低的趋势，在0～1 d 上升但差异不显著，1～45 d 逐渐降低（P＜0.05），不同青贮时间段peptide-N 含量表现为LB 组＞CE 组＞FA 组＞CK 组，青贮45 d 后LB 组peptide-N 含量显著高于其余各组（P＜0.05，图1e）。

TN 含量随青贮时间的延长逐渐降低，其中1～3 d 显著降低（CK 除外，P＜0.05），在不同时间段内，除处理3 d，CK 处理的TN 含量在其余时间段低于3 种添加剂处理，且CE 处理7 和15 d 以及LB 处理0、1、3、30 和45 d 均达到最大值，但与其他添加剂处理差异不显著（图1f）。

图1 不同添加剂对构树青贮饲料氮组分的动态影响Fig.1 Dynamic effects of different additives on nitrogen components in paper mulberry silage

2.5 隶属函数分析及综合评价

为综合评价不同添加剂对构树青贮饲料营养价值、发酵品质和蛋白质的影响，进行了构树青贮料各品质指标综合隶属函数分析，依据以下16 个指标的平均隶属函数值进行排序，其中，正相关指标是：DM、CP、CA、NDF、LA 和AA，负相关指标是：EE、CF、ADF、WSC、pH、PA、AN/TN、NPN、酸性蛋白酶和羧基肽酶。数值越大则综合营养价值越高，从表5可以看出综合营养价值从高到低为：LB 组＞CE 组＞FA 组＞CK 组。

表5 不同添加剂对构树青贮饲料营养价值、发酵品质和蛋白质降解的隶属函数分析Table 5 Membership function analysis of different additives on nutritional value，fermentation quality and protein degradation of paper mulberry silage

3 讨论

3.1 不同添加剂对构树青贮饲料营养品质的影响

在青贮过程中，青贮料的保存因植物的呼吸、微生物的蛋白酶活动及脱氨作用等而受到不利影响，进而造成原料营养成分流失［21］。本试验中，FA 组DM 和WSC 含量最高，且DM 含量显著高于CK 组，与LB 和CE 组差异不显著，WSC 含量显著高于其余各组，而Ash 含量FA 组显著低于LB 和CE 组，这与于浩然等［22］的研究结果类似，这主要是由于添加甲酸使得青贮料pH 迅速降低，植物呼吸受到抑制，从而保存了更多的DM 和WSC［23-24］。CP 含量在LB 组最高，显著高于CK 组，但与其余处理组差异不显著，与董志浩等［25］在对桑叶（Morus alba）青贮时添加乳酸菌的结果一致，可能是由于青贮发酵中较低的pH 值抑制了微生物的繁殖，而大多微生物多为细菌，失活的细菌主要由蛋白质构成保存在饲料中进而增加其含量［26］。CE 组EE 含量最高，显著高于其余各组，而CF 和NDF 含量最低，ADF 含量较低，CF 含量在FA、LB 和CE 组间差异不显著，NDF 含量显著低于各组，与陈光吉等［27］的研究结果一致，由于纤维素酶对植物细胞壁有降解作用，尤其是对纤维类物质的降解，进而提高能量价值［28］。

3.2 不同添加剂对构树青贮饲料发酵品质的影响

pH、有机酸含量、氨态氮/全氮（AN/TN）是评价青贮料发酵品质必不可少的指标。当青贮饲料的pH 值低于4.2［29］，乳酸含量范围在4%～6%［30］，AN/TN 在10%以下时［31］，可以将其评为优质饲料。本试验中，所有处理组pH、乳酸含量和AN/TN 均达到优质青贮饲料标准，且pH 值、PA 含量和AN/TN 较CK 组均显著降低，LA 和AA含量较对照组显著增加。调制青贮时，常添加甲酸添加剂作为防腐剂抑制有害微生物的滋生，来保证青贮过程中原料的品质，同时甲酸由于自身的酸化作用来降低pH 值，使饲料迅速达到稳定状态。代寒凌等［32］研究发现添加剂甲酸处理小黑麦（Triticale rimpau）和黑麦（Secale cereale）青贮能降低pH 值、PA 含量和AN/TN，提高LA 和AA 含量，不产生任何丁酸，本研究结果与此一致。刘辉等［33］对紫花苜蓿青贮研究也得出类似结论。纤维素酶添加剂可将植物细胞壁的结构性多糖降解为单糖，为乳酸菌提供充足的发酵底物，促进乳酸发酵，使发酵品质提高［34］。徐炜等［35］研究发现紫花苜蓿青贮时添加纤维素酶添加剂使pH、PA 含量和AN/TN 降低，LA 和AA 增加，Hristov［36］也得出类似的结论。添加乳酸菌可弥补青贮原料中乳酸菌数量的不足，当乳酸菌数量增加时，可有效利用青贮料中的可溶性碳水化合物发酵产生乳酸，使pH 值迅速降低，抑制有害微生物活动，进而阻止丁酸的产生。Filya 等［37］研究发现乳酸菌添加剂可以降低苜蓿青贮pH 和改善发酵品质，本研究结果与此一致。

3.3 不同添加剂对构树青贮饲料蛋白酶的动态影响

青贮过程中的蛋白降解是由植物蛋白酶以及微生物酶共同作用而引发的牧草蛋白的水解现象［38］。Rooke等［39］和Sullivan 等［40］认为植物蛋白水解酶在牧草萎蔫和青贮过程中对牧草真蛋白的降解发挥主要作用。酸性蛋白水解酶、羧基肽酶和氨基肽酶是牧草中存在的3 种主要植物蛋白水解酶，植物脱离土壤或其他生存条件后，自身代谢加快后会激活更多的蛋白酶将植物蛋白质水解为小肽、氨基酸和氨态氮［41］。因此这3 种酶的活力可以代表青贮饲料中蛋白降解的能力，以及潜在的有氧稳定性。在本试验中，酸性蛋白酶和羧基肽酶在青贮0～7 d 内FA 组的酶活性最低，这主要是由于甲酸的快速酸化，pH 迅速下降，使羧基肽酶的活性降至最低，并限制了肽的降解程度［42］。然而这两种酶在青贮30 d 后，LB 组的酶活性显著低于其余各组，可能是青贮后期乳酸菌大量繁殖，产酸量增加，导致pH 下降快，抑制了酶活性［43］。CE 组的3 种酶活性较FA 和LB 组高，这可能是由于添加纤维素酶作用下的发酵底物的水解产物较少［44］。而氨基肽酶活性在添加FA 和LB 后，到青贮第7 天就未检测到其活性，CE 与CK 组在青贮15 d 时失活，这与代艳［45］的研究结果相似。说明酸性蛋白降解酶和羧基肽酶在整个青贮过程中均对植物蛋白的降解起到了较为重要的作用，而氨基肽酶只在构树青贮的前7 d 对构树中植物蛋白的降解起到了分解作用。

3.4 不同添加剂对构树青贮饲料氮组分的动态影响

pH 值的大小能反映饲料能否良好的保存［46］，当pH 值下降到4.2 以下时，不仅能抑制不良微生物繁殖，保存更多的营养物质，还使得植物蛋白酶的活性降低，进而抑制蛋白降解［11］。在本试验中，所有处理组的pH 值在青贮过程中均逐渐降低，这种变化趋势与前人研究结果一致［47-48］。青贮0～3 d 的pH 下降较快，且FA 组显著低于其余各组，7 d 以后LB 组pH 最低，这可能是青贮前期甲酸自身的酸性使pH 迅速降低，而后期甲酸酸性减弱，乳酸菌数量增加，产生更多的乳酸使pH 值降低［49］。

青贮过程中蛋白质会降解为NPN，NH3-N、AA-N、peptide-N 大量生成［41］。TN 在整个青贮过程中呈下降趋势，这与崔鑫［12］的研究结果相一致，可能是添加剂使构树中蛋白水解并进一步分解成氨气或硫化氨等挥发性物质造成的。添加剂处理会不同程度抑制植物真蛋白降解为NPN［50］，一定程度上会增加青贮饲料中NPN、NH3-N 和AA-N 含量［51］，本试验中，NPN 含量在青贮前7 d 快速增加，尤其在青贮前1 d 最剧烈，之后缓慢增加，这可能是青贮前期较高的pH 和酶活性使蛋白降解较快［52］。AA-N 首先由植物蛋白酶分解产生，然后在梭菌等微生物的作用下进一步降解为氨以及胺等［14，52］，AA-N 和NH3-N 变化曲线基本一致，都逐渐上升，而前3 d 生成速率快，后期生成缓慢，说明在整个青贮过程中都发生了蛋白降解［42］。所有处理组的NPN、NH3-N 和AA-N 含量随时间的延长逐渐增加，且处理组均低于对照组，与葛剑等［53］的研究结果相一致，说明添加剂处理较CK 明显抑制了蛋白的降解，其中LB 组的效果最好，可能是本试验中基础添加糖蜜提供了充足的发酵底物使乳酸充分发酵。本试验中，peptide-N 含量随时间增加呈先增加后降低趋势，与Tao 等［54］的研究结果相似。peptide-N 含量在青贮前期的增加可能是由于青贮前期pH 值较高植物蛋白酶活性较高降解蛋白所致，后期逐渐降低是由于微生物蛋白酶利用肽氮进行自身的生长繁殖和降解肽为胺等物质，再者梭菌等有害微生物也能降解肽［42］。其中CK 组peptide-N 含量较其他处理组低，可能是由于所有处理组中CK 组pH 值较高，少许的大肠杆菌及梭菌存活进而降解肽［39］。