周诗晶，罗佳宁，刘仲淼，董超，秦燕，吴淑娟，甘红军，谢菲，庄光辉，伏兵哲，牛得草*

（1.草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，兰州大学草业科学国家级实验教学示范中心，甘肃 兰州730020；2.青海大学畜牧兽医科学院，青海省畜牧兽医科学院，青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室，青海 西宁810016；3.内蒙古自治区阿拉善盟林业草原和种苗工作站，内蒙古 巴彦浩特750306；4.宁夏大学农学院，宁夏 银川750021）

陆地生态系统中，植物与土壤间关系密切，植物生长特征的变化势必影响土壤养分的转化及肥力发展过程［1］，且土壤微生物作为联系土壤和植物的重要因素［2］，植物同土壤微生物之间存在强烈的交互作用，共同驱动着土壤养分的循环过程［3］。豆科（Leguminosae）植物作为植物界特殊的功能类群，能与环境中的固氮微生物共生形成根瘤菌，通过自身固氮作用吸收空气中的氮素，从而为土壤源源不断地提供氮源，另外，豆科植物能够积累较多的有机物（如生物量、根系分泌物），降低土壤对磷的吸附和富集作用，活化土壤中难以被利用的碳（C）、氮（N）和磷（P）等养分［4-5］，从而提升土壤肥力［6-7］。此外，豆科植物对土壤养分的选择性吸收反过来也影响到土壤养分的供给比例及总量，进而影响微生物的食物资源特征。土壤中有机养分的矿化主要由非共生的土壤微生物生长代谢所驱动［8-9］，土壤微生物胞外酶的合成与释放被视为土壤微生物的一种觅食策略，为适应环境资源供应特征的改变，微生物将通过调整养分活化关键酶的分泌过程及其计量比，来增加限制性元素的获取能力，从而来保证生物体内较强的化学计量内稳态［10-11］。土壤微生物胞外酶化学计量学是生态化学计量理论与生态学代谢理论的交叉，可以提高关于能量和养分束缚微生物代谢过程的认识［12］。近年来，许多学者对不同利用方式的土壤微生物养分代谢特征［13-15］进行了相关研究。杨文航等［15］研究表明，种植狗牙根（Cynodon dactylon）能提高土壤营养元素周转率及土壤微生物生物量。然而，目前关于豆科种植对土壤微生物的养分需求和养分代谢的影响过程仍然不是很清楚，限制了对土壤微生物驱动养分循环过程和机理的认识。

一年生豆科植物箭筈豌豆（Vicia sativa）是优质牧草，因为其生育周期短，对土壤和气候适应性较强，具有较强的固氮吸碳、改善土壤结构等功能，常作为绿肥植物，在土壤培肥及轮作倒茬等农艺措施管理中广为应用［16-17］。本研究以箭筈豌豆为例，采用盆栽试验，分别设置低密度组（19 株·盆-1）、高密度组（40 株·盆-1）和对照组（空白）处理，通过分析不同密度条件下种植箭筈豌豆的植物生物量及养分、土壤养分、土壤微生物生物量碳氮磷及其计量比和土壤酶活性等指标，研究种植箭筈豌豆对土壤养分及微生物养分代谢特征的影响，以便深入理解豆科植物与微生物的养分互作过程，并为土壤培肥及栽培草地的建植管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区基本概况

试验在兰州大学榆中草地农业生态系统实验站开展，该区属于典型温带大陆性季风气候，冬季干燥，夏季多风，昼夜温差较大，年平均气温10.3 ℃，年均降水量350 mm，雨季主要集中在6-9月，蒸发量1450 mm，年平均日照2446 h，无霜期约180 d，土壤类型为灰钙土。

1.2 试验设计

本研究为盆栽试验，供试土壤采自兰州大学榆中校区萃英山下农田耕作土壤，土壤养分含量如下：土壤有机质5.52 g·kg-1，全氮0.40 g·kg-1，全磷0.76 g·kg-1，速效磷3.40 mg·kg-1。

2019年6月10日，将混合均匀的土壤装入花盆，花盆高度20 cm，半径10 cm，土壤为3.5 kg，共计15 盆，花盆置于兰州大学榆中草地农业生态系统实验站试验地内，随机摆开。浇水至饱和，置放一周后，进行播种。

2019年6月17日，对花盆内土壤表层进行松土，随机选10 盆，各播入100 粒箭筈豌豆种子，浅覆土，所有花盆浇适量的水，待植物出苗2～3 cm 后，进行间苗工作，分别设置低密度组（5 盆）和高密度组（5 盆）及对照（5 盆）。低密度组为每盆内植株间苗至19 株，高密度组为每盆内植株间苗至40 株，对照组不种植。培养期间，适时浇水。

1.3 样品采集与测定

1.3.1 样品采集 2019年8月17日将箭筈豌豆分地上部和根两部分进行采集，分别称鲜重后，在105 ℃下杀青30 min，再于65 °C 烘箱中烘干至恒重；后采集土壤样品，剔除植物残体等肉眼可见的杂物，用四分法去除多余土样后过2 mm 筛。一部分土样自然风干，用于测定土壤有机碳、全氮、全磷含量；另一部分装入密封袋，储存于4 ℃冰箱中，用于测定土壤可溶性碳氮磷养分、土壤微生物生物量碳氮磷含量和土壤酶活性。

1.3.2 测定方法 1）植物养分的测定：取烘干的植物样品用冷冻混合球磨仪将样品粉碎，过0.150 mm 筛。采用碳氮元素分析仪测定植物样品中碳和氮含量，采用HClO4-H2SO4消化-钼锑抗比色法（紫外分光光度计UV-1600）测定植物样品中的磷含量［18］。

2）土壤养分的测定：土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）采用重铬酸钾氧化法测定［19］；土壤全氮（total nitrogen，TN）采用半微量凯氏滴定法测定［20］；土壤全磷（total phosphorus，TP）采用HClO4-H2SO4消化-钼锑抗比色法测定［18］。可溶性有机碳和总氮用2 mol·L-1KCl浸提，采用TOC-TN分析仪（Liqui TOC II，Elementar，德国）测定［21］；可溶性无机磷用0.5 mol·L-1NaHCO3萃取，在pH 8.5 下，采用钼酸盐-抗坏血酸法比色法（UV-1601，Shimadzu Inc.，日本）测定［18］。

3）土壤微生物生物量碳氮磷含量的测定：土壤微生物生物量碳（soil microbial biomass carbon，SMBC）、土壤微生物生物量氮（soil microbial biomass nitrogen，SMBN）和土壤微生物生物量磷（soil microbial biomass phosphorus，SMBP）的测定采用氯仿熏蒸－浸提法［22］。即将土样分成两份子样品，一份用2 mol·L-1K2SO4提取碳和氮，和0.5 mol·L-1pH 8.5 的NaHCO3提取磷。SMBC、SMBN 和SMBP 的含量通过计算熏蒸样品中元素的含量与未熏蒸样品中元素的含量的差值除以转换系数KE（熏蒸杀死的微生物体内C、N 和P 被浸提出来的比例）得到，SMBC、SMBN 和SMBP 的KE 分别为0.45、0.54 和0.40［23］。

4）土壤酶活性：采用对硝基酚（ρNP）底物分光光度法［24］测定4 种水解酶的活性，包括β-1，4-葡糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG，C-获取酶），β-1，4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-1，4-N-acetylglucosaminidase，NAG，N-获取酶），亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP，N-获取酶）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP，P-获取酶）。

1.4 数据分析与处理

采用Sigmaplot 14 软件作图，采用SPSS 24.0 进行统计分析，多重比较用One-Way ANOVA（单因素方差分析）进行检验（P＜0.05）。图表中的数据均为平均值±标准误，误差线为标准误。

2 结果与分析

2.1 箭筈豌豆的生物量及养分含量的变化

由图1可知，提高种植密度，箭筈豌豆地上组织C 和N 含量无明显变化，仅P 的含量较低密度组显著降低28.6%，最终，高密度组箭筈豌豆地上组织C∶P 和N∶P 较低密度组分别显著增加29.7%和21.0%，结果表明提高种植密度对箭筈豌豆地上组织C∶N 无显著影响。

图1 不同种植密度箭筈豌豆地上组织碳氮磷养分含量及计量比特征Fig.1 Contents of C，N and P and their mass ratios in the above ground biomass of V.sativa planted with different densities

种植密度对箭筈豌豆的生物量和碳、氮、磷养分积累量的影响表现出一致的规律性（表1），即与低密度组相比较，高密度组箭筈豌豆整体（每盆）地上、地下及总生物量和整体（每盆）碳、氮、磷养分积累量均增加显著，而单株水平植物生物量和碳、氮、磷养分积累在各处理间无显著差异。对于箭筈豌豆的养分积累总量C∶N、C∶P 和N∶P 计量比，种植密度的改变均对其影响不显著。总体而言，箭筈豌豆种植密度的增加提高了植物生物量及从环境中吸收碳、氮、磷养分总量，但对单株植物生物量和碳、氮、磷养分总量及养分计量比无显著影响。

表1 不同种植密度箭筈豌豆的生物量与养分积累量Table 1 Biomass and C，N and P accumulation in V.sativa planted with different densities

2.2 土壤养分的变化

种植不同密度的箭筈豌豆显著提高了土壤有机碳含量（表2），与空白对照组相比，低密度和高密度箭筈豌豆土壤有机碳分别提高了25.1%和20.9%，且高密度组与低密度组间无显著差异，土壤全氮含量在各处理间均无显著差异，种植箭筈豌豆对土壤全磷的影响，低密度组和对照相比无显著区别，但均显著高于高密度组。种植不同密度箭筈豌豆对土壤可溶性有机碳和可溶性总氮含量无显著影响，且与对照相比也无显著差异，但是，种植高密度箭筈豌豆土壤可溶性无机磷含量与对照组相比显著降低31.0%，而低密度组与对照组间相比无显著差异。相比对照组，种植箭筈豌豆对土壤可溶性养分计量比RC：N、RC：P、RN：P的影响不显著，且不同种植密度间土壤可溶性养分计量比也不存在显著差异。

表2 不同种植密度土壤的养分含量Table 2 Nutrient content of soil under different planting densities

2.3 土壤微生物生物量碳氮磷含量及其计量比的变化

种植不同密度箭筈豌豆对土壤微生物生物量碳氮含量影响较显著（表3），其中高密度组SMBC 含量显著高于低密度组和对照组，SMBN 含量表现出高密度组＞低密度组＞对照组，其低密度组、高密度组SMBN 含量较对照组分别显著增加71.9%和164.7%，种植不同密度箭筈豌豆对SMBP 含量无显著影响。分析土壤微生物生物量碳氮磷计量比发现：高密度和低密度组箭筈豌豆较对照显著降低了SMBC∶SMBN，但不同种植密度间无显著差异，且不同种植密度对SMBC∶SMBP、SMBN∶SMBP 无显著影响。

表3 不同种植密度下土壤微生物生物量碳氮磷含量及其计量比Table 3 Soil microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus and stoichiometric ratios under different planting densities

2.4 土壤酶活性的变化

种植箭筈豌豆显著改变了土壤微生物碳氮磷获取酶活性及其计量比（图2）。种植不同密度箭筈豌豆显著降低了土壤中β-1，4-葡糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG，C-获取酶）活性，其中低密度组、高密度组土壤BG 酶活性较对照组分别降低37.4%、52.0%，且高密度组土壤BG 酶活性低于低密度组；土壤中β-1，4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-1，4-N-acetylglucosaminidase，NAG，N-获取酶）和亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP，N-获取酶）活性随种植密度增加而增加，其中高密度组（NAG+LAP）酶活性显著高于对照组，是对照土壤的1.38 倍；种植箭筈豌豆显著提高了碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP，P-获取酶）活性，但不同种植密度间无显著差异。

图2 不同种植密度土壤酶活性及其计量比的变化Fig.2 Changes of the soil enzymatic activities and stoichiometric ratios on different planting densities

种植箭筈豌豆后，土壤BG∶（NAG+LAP）、BG∶AP、（NAG+LAP）∶AP 均显著降低，其中低密度组和高密度组的BG∶（NAG+LAP）之间差异显著，较对照组分别降低41.4%和64.4%。种植密度对BG∶AP 和（NAG+LAP）∶AP 无显著影响，不过，低密度组和高密度组土壤BG∶AP 较对照组分别降低78.8%和83.1%，低密度组和高密度组（NAG+LAP）∶AP 较对照组分别降低59.8%和48.7%。

3 讨论

3.1 不同密度箭筈豌豆生物量及养分吸收利用特征

植物的养分含量反映了植物的养分状态及其对养分的需求，与其生境的土壤养分有效性高度相关，并随土壤养分有效性的增加而增加［25-26］，反映了土壤提供养分的能力［27］。本研究中不同种植密度对箭筈豌豆地上组织碳氮养分含量无显著影响（图1），表明碳氮并未对植物生长起到限制作用，一方面是由于箭筈豌豆固氮能力强，另一方面当前的高密度处理（40 株·盆-1）下，箭筈豌豆生长还未对氮素营养供应特征产生密度制约效应。本研究中高密度处理箭筈豌豆地上组织磷养分含量较低密度组显著降低28.6%，表明植物生长受到土壤磷素供应不足的限制。Koerselman 等［28］的研究表明，植物地上组织N∶P 能够作为植物生长受土壤有效性N 和P 相对限制状况的诊断指标，N∶P＜14 时，植物表现为受N 限制；N∶P＞16 时，植物表现为受P 限制；N∶P 介于14 和16 之间时，植物表现为受N 和P 共同限制。本研究结果中，低密度组与高密度组箭筈豌豆地上组织N∶P 分别为14.65 和17.73，表明随种植密度的增加箭筈豌豆生长由氮磷共限制逐渐转向受P 的强烈限制。

本研究结果显示，箭筈豌豆单株生物量和养分积累量无显著变化，而高密度组的整体（每盆）生物量和养分积累量均高于低密度组（表1），表明提高种植密度增强了箭筈豌豆的群体效应，表现为生物量的增加及从环境中吸收的碳氮磷等养分增加，而高密度处理（40 株·盆-1）还未对箭筈豌豆生长产生明显的密度制约效应。

3.2 种植箭筈豌豆对土壤养分的影响

良好的土壤环境是草地可持续发展的重要条件，由于植物-土壤间关系密切，因此地上植物的变化势必影响地下土壤养分特征［1］。土壤有机碳作为土壤的重要组成部分，直接影响土壤水分、养分和植被以及土壤生物之间的关系，在土壤肥力、生态系统生产力中扮演着重要角色［29-31］。植物通过光合作用固定的碳，有20%～50%以植物根系分泌物与死亡的形式输入土壤［32］。土壤氮素和磷素在植物生长、微生物生长和活性以及生态系统功能的发挥中也起着重要作用，是影响植物生长的重要元素［29-31］。与碳的固定类似，豆科植物可以通过共生固氮，从环境中获得外源的氮素资源，以提高植物-土壤系统氮素的积累，而磷素属于沉积型循环，只是存在植物与土壤系统内部各组分库的转移［33-34］。本研究中，种植不同密度箭筈豌豆显著增加了土壤有机碳含量，但并未改变土壤全氮含量，土壤中氮素的固定与释放处于平衡状态，而土壤全磷含量仅在高密度组显著降低，主要是土壤磷元素向植物体内积累的缘故。本研究表明，种植不同密度的箭筈豌豆一定程度上提高了土壤养分含量，有利于草地的可持续发展。

可溶性有机碳、可溶性总氮和可溶性无机磷是土壤微生物从环境获取能量与物质的有效形态［35-36］。本研究显示，种植箭筈豌豆以及不同种植密度对可溶性有机碳和可溶性总氮含量影响不明显，而在高密度组可溶性无机磷显著降低，表明当前箭筈豌豆种植处理，改变了环境中土壤微生物磷素营养的有效性，且高密度组箭筈豌豆生长与微生物代谢对土壤磷素的需求存在强烈的竞争。土壤中可溶性养分计量比影响土壤微生物的生命活动，因为土壤微生物既需要碳素提供能量，又需要氮、磷素投资作为自身的组成成分［37］。例如，当土壤RC：N较高时，土壤微生物需要输入氮来满足它们的生长，反之，在RC：N较低时，过量的氮会被土壤微生物排泄到土壤中［38］。本研究中，种植箭筈豌豆对土壤可溶性养分计量比RC：N、RC：P、RN：P的影响不显著，且不同种植密度间土壤可溶性养分计量比也无显著差异，主要是由于可溶性有机碳、可溶性总氮受箭筈豌豆种植密度的影响表现出与可溶性无机磷相似的降低趋势，表明随箭筈豌豆种植密度增加，土壤中有限的可溶性总氮供应量可能也限制土壤微生物代谢，不过磷素限制更为强烈。

3.3 种植箭筈豌豆对土壤微生物量养分及土壤酶活性的影响

土壤微生物是土壤碳氮磷养分释放或固持的重要调节者［39-40］，土壤微生物量碳含量通常表示土壤中微生物的多少［41］，且土壤微生物C∶N∶P 计量比能反映其对养分的相对需求程度［42］。本研究中高密度组箭筈豌豆SMBC含量为194.42 mg·kg-1，显著高于对照组和低密度组，且SMBN 含量表现出高密度组＞低密度组＞对照组，表明高密度组处理促进了土壤微生物的繁殖，这是因为种植箭筈豌豆增加了植物向土壤输入的C 和N 的量，如根系分泌物等［30-31，43］，与SMBC 和SMBN 不同，种植不同密度箭筈豌豆对SMBP 含量无显著影响，且表现出随种植密度增加先降低后升高的规律。目前对于SMBP 含量受种植密度影响的研究较少，可能由于不同植物所需的磷含量不同而对种植密度产生不同响应，本研究中由于植物与土壤微生物对土壤养分资源存在竞争，尤其无法获得外源磷的输入，最终，土壤中磷素相对缺乏，SMBP 含量降低，高密度组箭筈豌豆地上组织的磷含量及N：P（＞16）也证实土壤磷素供应不足。本研究中，种植箭筈豌豆较对照显著降低了SMBC∶SMBN，且不同处理对SMBC∶SMBP和SMBN∶SMBP 影响不显著，表明种植箭筈豌豆后土壤微生物对氮素的相对需求量增加，很可能与土壤微生物群落结构的改变有关，通常细菌较真菌具有较高的氮素含量［44］，进一步暗示，种植箭筈豌豆后土壤中细菌比例显著增加，不过，还有待于进一步的试验验证。

土壤酶是一种具有生物催化能力和蛋白质性质的高分子活性物质，其中土壤水解酶的种类很多，以土壤微生物胞外酶占主导［45-46］。本研究所选择的4 种酶类（BG 酶、LAP 酶、NAG 酶和AP 酶）是土壤C、N 和P 转化的末端水解酶，与微生物养分代谢关系密切［13，46］。土壤微生物通过响应环境信号（例如低的养分可利用性）进行酶的生物合成，进而满足微生物养分需求［12，46］。土壤酶活性及其化学计量比能够很好地反映微生物生长过程中土壤养分有效性和土壤微生物对碳、氮、磷养分需求的变化［47］。本研究结果显示，种植箭筈豌豆后土壤BG 酶活性降低，而土壤（NAG+LAP）酶和AP 酶活性均增加，且土壤BG∶AP 和（NAG+LAP）∶AP 均低于对照组，BG∶（NAG+LAP）表现为对照组＞低密度组＞高密度组，上述结果表明，种植箭筈豌豆后土壤微生物增加了氮获取酶（NAG+LAP）和磷获取酶（AP）的分泌量，尤其是磷获取酶较对照显著增加，土壤酶活性及计量比的表现特征与土壤可溶性养分含量相配套，进一步支持土壤微生物生长受到了土壤中氮磷资源的限制。

4 结论

1）箭筈豌豆种植密度的增加提高了整体植物生物量，并增加环境中的养分吸收总量，导致植物生长由氮磷共限制逐渐转向受磷的强烈限制；2）种植箭筈豌豆对土壤可溶性无机磷和总氮含量的影响大于可溶性有机碳，但对土壤可溶性养分计量比RC：N、RC：P、RN：P的影响不显著；3）种植箭筈豌豆对SMBN 和SMBC 含量影响显著，且土壤微生物增加了氮获取酶（NAG+LAP）和磷获取酶（AP）的分泌量，致使碳氮磷获取酶计量比变化显著。