李倩，李晓霞，程丽琴，陈双燕，齐冬梅，杨伟光，高利军，新巴音，刘公社

（1.中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室，北京100093；2.山东省淄博第七中学，山东 淄博255000；3.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔161005）

CBF（C-repeat binding factor）基因是植物重要的抗逆基因，其属于AP2/ERF（ethylene response factor）转录因子家族，AP2/ERF 可分为AP2、ERF 和RAV 三个亚家族［1］。ERF 包括CBF/DREB 和ERF 两个亚家族，CBF/DREB 亚家族，只含1 个AP2/ERF 结构域。CBF 转录因子二级结构的C 末端为转录激活区，富含酸性氨基酸。N 末端为核定位信号区，富含碱性氨基酸，中间区为AP2/EREBP 结构域［2］。目前，CBF基因家族已经在多种植物中得以研究，其中拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中有6 个DREB1/CBF基因，即DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1A/CBF3、DREB1D/CBF4、CBF5、CBF6［3-5］。1997年Stockinger 从拟南芥中首次克隆出CBF1基因［6］。Jaglo-Ottosen 等［7］研究表明拟南芥CBF1是与CRT/DRE 序列结合的转录激活因子，CBF1过表达诱导COR（cold-regulated）基因表达，提高了拟南芥的抗冷性。1998年Gilmour 等［3］利用探针从拟南芥中分离出CBF2和CBF3基因，同时发现CBF1、CBF2和CBF3基因串联布置在拟南芥基因组的4 号染色体的8.7 kb 区域，与CBF1一样，CBF2和CBF3也受冷胁迫诱导，可与CRT/DRE 序列结合。2002年Haake 等［4］在拟南芥中获得了CBF4基因，该基因受干旱诱导，不受低温诱导。CBF4同样激活CRT/DRE，这些下游基因参与冷和干旱响应，转基因拟南芥更耐冷和干旱胁迫。拟南芥CBF5 蛋白最初是由Maceluch 等［8］和Lermontova 等［9］克隆得到的，AtCBF5可能在RNA 加工中具有必不可少的作用。Magome 等［10］从拟南芥中分离出一种新的赤霉素（gibberellin，GA）缺陷型突变体ddf1。DDF在系统发育上接近DREB1/CBF基因，DDF1被高盐胁迫诱导，过表达DDF1的转基因植物对高盐度胁迫的耐受性增强，参与了GA 生物合成和胁迫耐受性的调节。拟南芥DDF2/CBF6是由盐胁迫而不是由冷胁迫诱导的［11］，目前关于拟南芥CBF5和CBF6的报道较少。除拟南芥外，研究人员也对其他植物CBF基因进行了研究。在小麦（Triticum aestivum）中，大多数CBF基因位于5 号染色体的长臂上，与耐冷基因具有紧密的联系［12］。Choi 等［13］从大麦（Hordeum vulgare）中克隆了HvCBF3基因，其定位在5 号染色体上，位于抗寒数量性状基因座的附近。Dubouzet 等［14］从水稻（Oryza sativa）中分离了5 组CBF基因，研究表明A-1 组基因由低温诱导，而A-2 组基因由盐和干旱诱导。过表达OsCBF基因的转基因水稻的抗寒性、抗旱胁迫性、抗盐性都得到提高［15］。葡萄属（Vitis）的CBF4基因主要由冷诱导，CBF1，CBF2和CBF3基因对干旱胁迫具有更好地响应［16］。总之，在非生物胁迫条件下，转录因子CBF 可以识别下游COR基因启动子上的顺式作用元件CRT/DRE，激活COR基因的表达，其参与冷、干旱、盐等多种胁迫信号途径，可提高植物抗逆性［17］。

羊草（Leymus chinensis）是禾本科多年生牧草及生态草，广泛分布于欧亚草原的东部，是草原的优势种。其生态适应范围广，抗逆性强，是天然的抗逆基因资源库［18］。且其营养价值高、可再生能力强，能有效改良草原生态环境［19］。系统发育分析表明，羊草与小麦和大麦具有密切的系统发育关系［20］。因此，关于羊草抗逆研究在草原修复和作物抗逆性提高等方面都具有重要价值。前期研究表明羊草的非生物胁迫响应途径主要有3 个：ABA、JA 和CBF 途径［21］。其中CBF 途径是拟南芥和水稻中的典型冷应答途径。本课题组前期已对抗逆相关的转录因子进行了大量研究，结果表明LcDREB2a和LcMYB1基因可提高转基因拟南芥的抗盐性［22-23］。Li 等［24-25］从羊草中克隆获得羊草盐胁迫诱导新基因LcSAIN1和LcSAIN2，发现过表达这两个基因可提高转基因植物对盐胁迫的抗性。Gao 等［26］发现了一种新型的转录因子LcFIN1，其被冷胁迫诱导，可能参与冷胁迫的早期响应，增强转基因植物的冷胁迫耐受性，LcCBF1与位于LcFIN1启动子区域的CRT/DRE 顺式元件结合，LcFIN1受LcCBF1直接调节，而关于羊草CBF基因家族一直缺少系统的研究。本研究克隆得到羊草的CBF6（L.chinensisC-repeat binding factor 6）基因，将其转入拟南芥中进行功能验证，这为羊草CBF基因家族功能解析及牧草的抗逆分子机制提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

羊草材料种植地为中国科学院植物研究所羊草种质资源圃（东经116°12′，北纬39°59′）。羊草种子采用双层滤纸法萌发，光照强度40 lx，相对湿度35%，温度（28 ℃，12 h 昼）/（16 ℃，12 h 夜）中进行萌发试验。在培养皿中培养至5～6 cm 幼苗时，移栽至混合土（混合比例营养土∶蛭石为2∶1）中培养，材料收集时间为2018年。拟南芥野生型（ecotype Columbia，Col-0）种植于培养室中，培养介质为营养土与蛭石（2∶1）混合土，温度为23 ℃。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 材料处理 羊草LcCBF6基因的组织特异性表达模式分析：选取正常生长8 周的耐盐羊草种质W3 和敏盐羊草种质S4，分别取根、叶、种子组织，液氮速冻，-80 ℃超低温储藏。盐胁迫处理下羊草基因LcCBF6表达模式分析：选取正常生长8 周的耐盐羊草种质W3 和敏盐羊草种质S4，进行高盐（200 mmol‧L-1NaCl）处理4 h，取根和叶。同时，取200 mmol‧L-1NaCl 处理4 h 的种子材料，液氮速冻，-80 ℃超低温储藏。

1.2.2 总RNA 提取和cDNA 合成 将羊草材料分别按照各自试验设计进行处理，各处理取材料0.1 g，5 次重复。用多糖多酚植物RNA 提取试剂盒（华越洋，北京），提取各处理材料总RNA，并用DNaseI（Takara，Japan）消化DNA，具体操作参照试剂盒说明书。采用1%的琼脂糖凝胶电泳和Biodropsis BD-2000 进行RNA 质量检测。将提取出的RNA 使用PrimeScript™RT Reagent Kit 试剂盒进行反转录合成cDNA。反应体系为10 μL：5×PrimeScript® Buffer（4 μL），PrimeScript® RT Enzyme Mix I（1 μL），Oligo dT Primer（1 μL），Random 6 mers（1 μL），Total RNA（1 μg），RNase-free dd H2O（up to 10 μL）。反应条件：37 ℃30 min；85 ℃15 s，合成后的cDNA 存贮于-20 ℃备用。

1.2.3 基因克隆及载体构建 通过检索本课题组前期羊草盐胁迫转录组数据库，获得CBF6基因序列。将该序列在NCBI 上比对发现该序列为CBF家族基因，命名为LcCBF6，根据其保守序列，用Primer 5 设计基因序列克隆引物：LcCBF6-F（GGACTGAATCGGAGGAAGAAGA），LcCBF6-R（GTGACCGTACAGCAGCACAAA），以cDNA 为模板，进行PCR 扩增反应［27］。冰上配制反应液，模板最终浓度为10～20 ng ‧ μL-1，混匀后离心，PCR反应程序：95 ℃5 min；35 个循环（95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min）；72 ℃，2 min。PCR 反应体系为20 μL：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）（2 μL），dNTP Mixture（3.2 μL），cDNA（100 ng），Primer-F（0.6 μL），Primer-R（0.6 μL），LA Taq（0.2 μL），ddH2O（up to 20 μL）。取5 μL 扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离PCR 产物，将目的片段用胶回收试剂盒回收（上海生工），方法参照试剂盒说明书。回收产物利用带有酶切位点的引物：XbaI（TCTAGAATGTGTCCGATCAAGAAGG），SacI（GAGCTCCTAGCTAGCTGTGGTAGCT）进 行PCR 扩增，胶回收得到的序列即为带有酶切位点的LcCBF6基因序列。

将上述胶回收产物连接到pMD19-T 克隆载体，转化到大肠杆菌DH5a，并进行测序分析。用TaKaRa miniBEST 质粒提取试剂盒分别提取pMD19-T-LcCBF6与pSN1301 质粒，利用XbaI 和SacI 分别对pMD19-TLcCBF6和pSN1301 质粒进行酶切并连接，具体操作参照试剂盒说明书。

1.2.4LcCBF6基因生物信息学分析 通过NCBI 数据库进行LcCBF6基因及同源基因序列的搜索和比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；使用DNAMAN 进行多序列比对；使用ClustalX 2 和MEGA 6.0 进行蛋白质比对分析及系统进化树构建；使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对LcCBF6进行蛋白特性分析。

1.2.5LcCBF6基因表达分析 根据LcCBF6基因序列设计荧光定量引物为：LcACTIN-F（TGCTGACCGT ATGAGCAAAG），LcACTIN-R（GATTGATCCTCCGATCCAGA），LcCBF6-F（AGTCGTCCTCTTCCCCA GCG），LcCBF6-R（CGTAGTACAGGTCCCAGCCCAT），羊草Actin基因序列为内参引物［24-25］。采用荧光定量PCR 方法，分析羊草LcCBF6在羊草不同组织（种子、根、叶）中NaCl 处理下的表达情况。定量PCR 体系和条件按照（TaKaRa LA Taq®，RR02MA，TaKaRa）试剂盒说明书进行操作。反应程序为：95 ℃，30 s；45 个循环（95 ℃，5 s；68 ℃，30 s）。定量PCR 反应完成后，采使用2-ΔΔCt方法对所得数据进行分析［28］。

1.2.6 拟南芥转化及阳性苗PCR 鉴定 将构建好的融合载体pCAMBIA-3301-LcCBF6转入农杆菌GV3101中，采用花序侵染法［29］将处于花蕾期的野生型拟南芥的花序浸泡在侵染液中，保持1～2 min，侵染后以较高的湿度在培养箱中暗培养24 h 后正常培养，直至拟南芥正常开花结果，收获种子。将转化后的拟南芥种子，用10%的次氯酸钠进行灭菌，将灭过菌的种子种植于含50 μg‧mL-1潮霉素或卡那霉素（kanamycin，Kan）的固体MS 培养基上，并将经过抗性筛选后仍然长势良好的拟南芥初步确定为阳性苗。将阳性幼苗移栽到土里继续生长，待其生长状态良好后，提取叶片基因组DNA，用PCR 法进一步鉴定，阳性苗PCR 鉴定引物：LcCBF6-F（ATGTGTCCGATCAAG AAGGAG），LcCBF6-R（CTAGCTAGCTGTGGTAGTTCCA）。T1代种子种植后单株所收种子为T2代，理论上T2代应该出现3∶1 的分离，选取T3代中的纯合体株系进行生物学试验分析。

1.2.7LcCBF6转基因拟南芥耐盐分析 种子萌发阶段耐盐性试验：将3 个LcCBF6转基因拟南芥株系（Line1、Line2、Line5）和野生型拟南芥的种子播种在含有0，100，125，150 和200 mmol‧L-1NaCl 的MS 培养基（MS 粉4.4 g，蔗糖30 g，琼脂粉15 g，加水至1000 mL，pH 5.8）上。萌发温度设置为23 ℃，每皿40 粒种子，3 次生物学重复，观察种子的萌发情况，并统计绿色子叶数和鲜重。盐胁迫根长抑制试验：将LcCBF6转基因拟南芥3个株系（Line1、Line2、Line5）及野生型拟南芥的种子分别播种在MS 培养基上生长4 d 后，将其幼苗移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol‧L-1NaCl 的MS 培养基上，3 次生物学重复，斜放培养基，1 周后测量根长。幼苗抗盐试验：将LcCBF6转基因与野生型拟南芥种子在MS 培养基萌发7 d 后，将长出的幼苗分别移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol‧L-1NaCl 的MS 培养基上。继续培养3 周后，观测幼苗的生长状况并统计其存活率和鲜重，3 次生物学重复。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 和SPSS 软件对所得数据进行统计分析，使用Microsoft Excel 软件作图。

2 结果与分析

2.1 羊草LcCBF6 基因的克隆及结构功能预测

依据基因转录组测序数据设计引物，从羊草中克隆得到LcCBF6基因，该基因开放阅读框（open reading frame，ORF）为738 bp。使用ProtParam 对LcCBF6 进行蛋白特性分析，发现LcCBF6ORF 编码245 个氨基酸，分子量为26 kD，等电点（isoelectric point，PI）为6.45。NCBI 序列比对发现LcCBF6 存在大量相似蛋白，均含有保守的AP2 结构域，属于该家族转录因子。LcCBF6 与蒙古冰草（Agropyron mongolicum）CBF6 蛋白同源性最高，为92%，其次与两芒山羊草（Aegilops biuncialis）CBF6 蛋白的同源性为90%，与山羊草（Triticum triunciale）CBF6蛋白的同源性为88%，与黑麦（Secale cereale）、小麦、大麦和黑麦草（Lolium perenne）的CBF6 蛋白的同源性分别为91%、88%、91%、76%（图1）。利用MEGA 构建了LcCBF6 及其同源蛋白的系统进化树，发现羊草LcCBF6 在进化上与小麦、大麦、蒙古冰草、黑麦和山羊草的亲缘关系较近（图2）。

图1 LcCBF6 基因编码蛋白序列比对分析Fig.1 Sequence alignment analysis of LcCBF6 gene coding protein

图2 LcCBF6 系统进化树Fig.2 LcCBF6 phylogenetic tree

2.2 羊草基因LcCBF6 的表达模式分析

组织特异性分析结果表明，LcCBF6基因在羊草的种子、叶、根中的表达存在差异，根中表达量最高，种子次之，叶中最低。耐盐性不同的两种羊草种质中LcCBF6的表达量存在差异，该基因在耐盐种质W3 的表达量高于敏盐种质S4（图3A），推测羊草LcCBF6基因与植物耐盐性相关。

对羊草敏盐种质S4 和耐盐种质W3 进行200 mmol‧L-1NaCl处理4 h 后，分别提取种子、叶、根的RNA，对不同组织中LcCBF6的表达模式进行检测，结果表明在盐胁迫下，种子和叶片中LcCBF6基因均上调，但耐盐种质W3 的上调倍数大于敏盐种质S4。根中敏盐种质S4 的LcCBF6基因上调，耐盐种质处理前后差异不显著（图3B）。这表明LcCBF6基因受盐诱导表达，且不同耐盐性种质中的表达存在差异，推测该基因可能参与植物对盐胁迫的响应。

图3 LcCBF6 基因的表达模式Fig.3 Expression patterns of LcCBF6 gene

2.3 盐胁迫对过表达LcCBF6 拟南芥种子萌发的影响

为了进一步明确LcCBF6的基因功能，本研究构建了双子叶植物表达载体pCAMBIA3301-LcCBF6（图4A），并进行拟南芥转化，在获得的转基因株系中，选取3 个株系（Line1、Line2 和Line5，图4B）的T3代纯合体种子对盐胁迫下的萌发情况进行检测。结果表明萌发期盐胁迫对野生型和转基因拟南芥的绿色子叶数和鲜重均产生影响。但与野生型植株比较，这种生长抑制在LcCBF6转基因植株中表现较轻。在125 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型植株的绿色子叶率为16%，3 个转基因植株的绿色子叶率分别为30%、52%和50%。测定植株鲜重发现，在对照条件下，转基因和野生型鲜重没有显著差异。但是，在125 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型鲜重为26.66 mg·10 plant-1，3 个转基因拟南芥的鲜重分别为41.66、57.33 和51.33 mg·10 plant-1。即在盐胁迫下，转基因拟南芥的绿色子叶数和鲜重均显著高于野生型（图5）。

图4 植物表达载体pCAMBIA3301-LcCBF6 酶切鉴定及转基因株系PCR 鉴定Fig.4 Identification of plant expression vector pCAMBIA3301-LcCBF6 by enzyme digestion and PCR identification of transgenic line

图5 NaCl 胁迫对LcCBF6 转基因拟南芥种子萌发的影响Fig.5 Effects of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis seed germination under NaCl stress（mean±SD，n=3）

2.4 盐胁迫对LcCBF6 过表达拟南芥幼苗期的影响

进一步对转基因和野生型拟南芥幼苗期耐盐性进行比较。将在MS 培养基上培养7 d 的转LcCBF6基因和野生型拟南芥幼苗移栽到含有不同NaCl（0～200 mmol‧L-1）的培养基上，选择长势相同的拟南芥幼苗移苗，3 周后观察生长情况。结果表明，在无NaCl 处理的情况下转基因和野生型株系生长状况较好；但在150 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型植株大部分枯萎，转基因植株大部分仍然存活（图6）。

存活率统计发现150 mmol‧L-1NaCl 处理3 周后野生型存活率为47.22%，LcCBF6三个转基因拟南芥株系存活率分别为86.11%、91.66%和83.33%。200 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型存活率为5.56%，而LcCBF6转基因拟南芥3 个株系的存活率分别为55.56%、36.11%和41.67%。同时，每个处理取10 株幼苗统计其鲜重，发现150 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型的鲜重为238 mg·10 plant-1，而3 个LcCBF6转基因拟南芥株系的鲜重分别为311、302 和384 mg·10 plant-1。200 mmol‧L-1NaCl 处理下，野生型拟南芥鲜重为99 mg·10 plant-1，而3 个转LcCBF6基因植株鲜重分别为170、223 和178 mg·10 plant-1（图6）。这表明LcCBF6转基因株系幼苗期耐盐性显著高于野生型，即LcCBF6基因可以增强幼苗期拟南芥的耐盐性。

图6 转LcCBF6 基因拟南芥幼苗抗盐表型Fig.6 Salt-resistant phenotype of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis in seedlings stage（mean±SD，n=3）

2.5 转LcCBF6 基因提高盐胁迫下转基因拟南芥根长

为了研究盐胁迫对转基因拟南芥根系的影响，将拟南芥幼苗移栽到含有0～200 mmol‧L-1NaCl 的培养基中，斜放培养皿，生长7 d 后测量根的伸长率。发现野生型和转基因植株在对照条件下根长没有显著差异。但是，150 mmol‧L-1NaCl 胁迫后野生型拟南芥植株根长仅为13 mm，而转LcCBF6基因植株3 个株系的根长分别为15、20 和24 mm（图7），这说明转LcCBF6基因减轻了盐胁迫对拟南芥根长的抑制作用。

图7 NaCl 胁迫对LcCBF6 转基因拟南芥根长影响Fig.7 Effects of NaCl stress on root length of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis plants（mean±SD，n=3）

3 讨论

逆境胁迫对农作物产量和生态环境造成极大的威胁，牧草植物对外界环境具有较强的适应能力，因此挖掘牧草植物抗逆基因，分析其抗逆机制已经成为当下的研究趋势［30］。CBF 转录因子，也称为DREB1 蛋白，是植物抗逆相关的转录因子。研究表明CBF 转录因子识别CRT/DRE 顺式作用元件，只含1 个AP2/ERF 结构域，含有保守CCGAC 序列，当植物受到低温胁迫后，CBF基因迅速激活下游COR基因。目前已经在许多植物物种中分离出CBF基因，例如拟南芥［2］、大豆（Glycine max）［31］、番茄（Lycopersicon esculentum）［32］、小麦［11］、大麦［12］和玉米（Zea mays）［33］等。在拟南芥中，CBF1、CBF2和CBF3主要参与冷胁迫相关途径，CBF4参与冷和干旱响应途径，CBF5和CBF6主要受高盐胁迫诱导［10-11］，这表明拟南芥CBF基因家族存在功能分化［34］。而羊草是草甸草原的建群种，抗逆性强，具有优越的草地生产性能，因此对羊草抗逆基因资源方面的研究意义重大［35］。本研究对羊草CBF6基因进行克隆及分析，结果表明，LcCBF6含有保守的AP2 结构域，属于CBF基因家族，与小麦CBFFIIIa-6.1基因同源性为88%（图1）。有研究表明CBFIIIa-6.1在冬季小麦品种中表达量高，并且受冷胁迫诱导［36］。同时LcCBF6与大麦HvCBF6基因同源性为91%，研究发现HvCBF6对冷处理延迟响应，在冷处理8 h 后首次检测到，并在24 h 达到峰值，HvCBF6激活COR基因在无冷胁迫（即温暖）条件下的表达［37］。系统进化分析发现羊草LcCBF6在进化上与小麦、大麦亲缘关系较近（图2）。因此，推断LcCBF6基因功能可能与CBFIIIa-6.1、HvCBF6具有相似性，参与植物对非生物胁迫的响应。

前期研究表明，羊草CBF基因家族基因的表达具有组织特异性，其中LcDREB3a在叶中表达量最高，其次是横走根茎和根，在叶鞘中的表达量最低［38］。而本研究发现LcCBF6基因在根中表达量最高，种子中表达量次之，叶中表达量最低，这表明羊草CBF基因家族不同基因的组织表达情况存在差异。此外，前人研究发现拟南芥AtCBF6在盐胁迫下，影响赤霉素（gibberellin，GA）的表达水平，导致侏儒症和延迟开花等［11］。而本研究表明耐盐性不同的两种羊草种质中LcCBF6的表达量存在差异，耐盐种质W3 的LcCBF6基因表达量高于敏盐种质S4。同时，在盐胁迫条件下，种子和叶片中LcCBF6基因均上调，且耐盐种质W3 的基因上调倍数大于敏盐种质S4；根中敏盐种质S4 盐胁迫后LcCBF6基因上调，耐盐种质W3 处理前后LcCBF6基因差异不显著（图3）。上述结果表明该基因受盐诱导表达，并且可能与羊草耐盐性相关。

Zhang 等［32］从番茄中克隆到了LeCBF1～LeCBF3（L.esculentum CBF1-3）基因，其中LeCBF1参与冷胁迫响应。Qin 等［33］使用酵母单杂交技术分离玉米的ZmDREB1A基因，ZmDREB1A受冷和高盐胁迫诱导，可提高转基因拟南芥的抗旱和抗冻能力。Xiao 等［39］从野葡萄（Vitis riparia）和栽培葡萄（Vitis vinifera）中分离出CBF1～CBF3基因，研究表明寒冷、干旱和外源脱落酸（abscisic acid，ABA）均能诱导葡萄CBF基因的表达。Kidokoro 等［31］从大豆中鉴定出14 种GmDREB1s，GmDREB1 激活GmPYL21的表达，不依赖ABA途径增强ABRE 介导的基因表达，激活HSF，再激活HSP 参与植物耐热途径，GmDREB1基因在提高植物耐热性和抗旱性中发挥重要作用。这些结果表明CBF 途径不仅在参与植物抗冷调节，在干旱和盐碱胁迫途径中也发挥了关键性的作用。本研究发现，过表达LcCBF6可以显著提高转基因拟南芥的抗盐性，表明LcCBF6基因可能参与植物对盐胁迫响应，提高转基因植株的耐盐性（图5～7），这与前人研究的拟南芥CBF6基因功能具有一定的相似性［11］。本研究结果进一步丰富了羊草抗性基因资源，为牧草及重要农作物的抗逆分子育种提供了优异基因资源。