杨凯，史娟，袁玉涛，王立婷

（宁夏大学农学院，宁夏 银川750021）

白三叶（Trifolium repens）属于豆科（Leguminosae）三叶草属（Trifolium），原产于欧洲和北非，是我国广泛栽培应用的优质豆科牧草之一［1-2］，常见的野生种有白三叶、红三叶（Trifolium pratense）、草莓三叶草（Trifolium fragiferum）和野火球（Trifolium lupinaster）4 种［3-4］。三叶草生态适宜性强，在改善国内外城镇土壤有机质、培肥地力、绿化和水土保持等方面发挥着重大作用［5］，因其营养物质丰富、适口性好、品质优良，已成为反刍动物的重要饲料来源［6-8］。目前，国家致力于农业结构改革和草畜产业的发展，三叶草因其品质优良、观赏性强被广泛种植。

白粉病是牧草生产过程中的主要真菌病害。豆科、禾本科属的多种牧草均可被白粉菌侵染［9］，白粉菌侵染不仅使牧草光合速率下降，叶片早枯，且对牧草的品质及产量产生一定影响，在我国新疆、吉林、江苏等地均有报道［10］。杨芬［11］以有性阶段的闭囊壳和无性孢子特征，将新疆园林草坪三叶草白粉病病原无性时期鉴定为半知菌亚门粉孢属（Oidium），有性时期为子囊菌亚门白粉菌属（Erysiphe）；桑维均等［12］研究表明贵阳地区红三叶草白粉病以菌丝体和分生孢子在植株上越冬、越夏，成为来年侵染源，但未发现有性世代。袁玉涛等［13］依据分生孢子和闭囊壳形态特征，明确了宁夏地区紫花苜蓿（Medicago sativa）白粉病病原为蓼白粉菌（Erysiphe polygoni）。李帅等［14］研究番茄（Lycopersicon esculentum）白粉病病原，因未发现闭囊壳，利用无性态分生孢子特征及分子鉴定法明确了黑龙江省番茄白粉病病原种类。宁夏气候干旱，白三叶草作为重要的园林绿化草种，白粉病发生逐年加重，有关致病菌的分类地位目前尚不明确，因此，明确宁夏地区白三叶草白粉病病原菌的种类，可为指导防控提供依据。

植物病原真菌顺利侵入寄主进而建立寄生关系是发病的基础。当病原菌侵入寄主时，通常会产生一些侵染结构，如附着胞、侵染钉等来帮助侵入，对于专性寄生型真菌，通常以吸器进入寄主细胞获得营养，并与寄主建立寄生关系［15］。白粉菌是典型的活体营养型真菌，在植物体内以吸器的形成标志和寄主建立寄生关系［16］。任斌等［17］使用光学显微镜及透射电镜观察了叶枯病菌侵染苹果（Malus domestica）叶片的发育情况及侵染过程，研究表明接种9 h 分生孢子萌发产生芽管且附着胞形成，1 d 后芽管顶部形成次级分生孢子，2 d 后次级分生孢子萌发形成附着胞，3 d 后附着胞演变为侵染钉侵入寄主，表皮细胞内可见初生及次生菌丝形成且叶片显症。杨若林等［18］通过半薄及超薄切片观察了白粉菌侵染小麦（Triticum aestivum）叶片细胞的显微及超微结构变化，结果发现受感染小麦叶片细胞细胞壁沉积大量团状电子致密颗粒，线粒体膜解体，叶绿体由椭圆形变为圆形。研究结果对于解析寄主感病引起的病理变化以及深入揭示病原菌的侵入机制提供了重要的细胞学证据。为了揭示白三叶草白粉病菌侵入寄主及其引起的细胞病理学特征，本研究对白粉病菌的生物学特性以及白粉菌侵染寄主的组织病理学特征进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白三叶草种子由宁夏大学农学院牧草分子育种研究室提供。

白三叶草白粉病菌菌株：来源于宁夏银川市绿化地自然感染白粉病的白三叶草上，以BF 表示。

1.2 主要化学试剂

真菌DNA 提取试剂盒（Biospin®Fungus Genomic DNA Extraction Kit）购于BioFlux 公司；2×EcoTaq®PCR SuperMix（+dye）购自北京全式金生物技术有限公司；水合氯醛和三氯乙酸购于博奥生物集团有限公司；乙醇、氯仿和苯胺蓝购于天津大茂化学试剂有限公司。

1.3 白三叶草的培育、白粉病菌的繁殖及接种方法

1.3.1 白三叶草的培育 2018年6月采用盆栽法培育白三叶草。将无菌基质土（基质∶土=1∶1）拌水，装入10盆直径为15 cm 的花盆中1/2 处，选饱满的白三叶草种子在55 ℃恒温水中浸泡2 h 以催芽，均匀地播撒在花盆中，覆基质土1 cm，浇透水，用保鲜膜保湿，置于RQX-250 智能人工气候箱（上海甄明科学仪器有限公司，中国）培育，培育条件设定为：温度25 ℃、14 h/10 h 光暗交替4000 lx、湿度75%，出苗后去掉保鲜膜，正常管理，长至四叶一心时进行接种。

1.3.2 白粉病菌的繁殖 采集新鲜的BF 菌株，接种于盆栽培养的健康白三叶草叶片上，放入培养室培养。促其产生大量白粉层，作为接种菌源。

1.3.3 接种方法 采用震动抖落法接种［13］。采集长满新鲜白粉菌的白三叶草叶片，置于被接种白三叶草叶片上方4～7 cm 处，轻轻震动，使白粉菌均匀落在被接种叶片，5 min 后在接种叶片上方喷雾。

1.4 病原菌在寄主表面的萌发特征及侵染寄主的超微结构观察

1.4.1 白粉菌侵染白三叶草表面症状观察 按照1.3.3 方法进行。于接种后每隔1 d 观察1 次。观察叶片显症和病斑扩展的时间。

1.4.2 白粉菌在白三叶草表面萌发特征观察 采用叶片透明法［19］，将接菌的叶片每隔3～4 h 取样置于脱色液中脱色24 h 后倒掉脱色残余物换为透明液，24 h 后取出透明好的叶片使用苯胺蓝染色液染色5 min 后观察，使用BX53 显微镜（奥林巴斯株式会社，日本）观察分生孢子、芽管、附着胞、菌丝及分生孢子梗的形态和大小，并测量拍照做好记录。

1.4.3 透射电镜样品的制备和观察 参照康振生［20］的方法制备样品。将制备好的样品在解剖镜下进行修块，在EM KMR3 超薄切片机（Leica 公司，德国）上切片，用1%甲苯胺蓝染色液染色，经流动水冲洗染色液并烤干，在显微镜下进行观察和拍照。利用半薄切片进行样品定位，超薄切片经2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色并晾干，使用1200 EX 透射电子显微镜（日本电子株式会社，日本）观察并拍照。

1.5 病原菌形态特征观察

采用光学显微镜直接观察。滴一滴无菌水于载玻片上作为浮载剂，将白粉菌抖落在载玻片上，盖上盖玻片，在BX53 显微镜（奥林巴斯株式会社，日本）下观测病原菌形态特征。

1.6 病原菌分子生物学鉴定

1.6.1 样品DNA 的提取 采用单斑繁殖纯化白粉病菌，反复多次培养获得生长一致的白粉病菌菌落，用灭菌手术刀片轻轻刮取叶片表层菌丝，称取0.1 g 白三叶草白粉菌菌丝，使用真菌DNA 提取试剂盒［Biospin®Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux 公司）］提取白三叶草白粉病病菌菌丝体DNA［21］，使用Simpli Nano 超微量分光光度计（GE 公司，美国）测定浓度，-20 ℃保存备用。

1.6.2 引物选择与PCR 扩增 使用rDNA-ITS 通用引物序列ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对提取的白三叶草白粉病菌菌丝体DNA 进行PCR 扩增。PCR 反应体系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL，ITS1 引物0.5 μL、ITS4 引物0.5 μL，ddH2O 补足。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共设置35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察拍照后，回收产物交由昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司测序。将菌株测序所得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行BLAST 同源性比对，基于GenBank 中报道的相关病原菌的序列信息豌豆白粉菌（Erysiphe pisi）（登录号为KY661145.1 和KY661137.1），采用邻接法（neighbor-joining method），通过Mega 5.1 软件构建系统发育树，自展重复数为1000 次。确定白粉病菌菌株的分类地位。

1.7 分生孢子生物学特性观察

设温度、pH 和光照3 个处理。其中温度梯度处理为5、10、15、20、25、28 和30 ℃；pH 值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0；光照处理为全黑暗、12 h 光照×12 h 黑暗交替、全光照。

采用水琼脂玻片法［22］观察。每个处理3 次重复，置于RQX-250 智能人工气候箱（上海甄明科学仪器有限公司，中国）培养，分别于4、6、8、12 和24 h 观察。观察分生孢子的萌发，计算萌发率，每重复观察统计3 个视野，每视野观察到的孢子个数≥100 个。

萌发率（%）=分生孢子的萌发个数/视野内总孢子数×100

1.8 数据分析

采用SPSS 20.0 进行单因素方差分析，用Duncan 多重比较进行差异显著性分析（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 白粉菌侵染白三叶草叶片症状观察

接种后第4 天，叶片表面显症，出现稀疏的白粉层（图1B）；第5 天，白粉层逐渐加厚并开始扩展（图1C）；第6 和7 天，粉斑扩展至叶片的1/3～2/3（图1D，E）；第10 天，粉层覆盖率达到90%以上，粉层加厚，此时叶片出现卷曲（图1F）；15～20 d，整个叶片粉层加厚，叶片变黄，萎蔫，并逐渐枯落（图1G，H），但始终没有观察到闭囊壳。由4 d显症至15 d 布满整个叶片大约需要11 d，通过比叶重法测定叶片面积，得到菌丝生长速率为34.47 mm2·d-1。

图1 白粉病菌危害白三叶草叶片症状Fig.1 Symptoms of leaf damage of T.repens by E.pisi

2.2 分生孢子在叶片表面的萌发特性观察

在25 ℃条件下，接种在叶片上的分生孢子，4 h 时开始萌发，在分生孢子顶端肩胛处长出初生芽管（图2A），10 h 后芽管顶端膨大，形成椭圆形或球形的附着胞（图2B）；部分孢子另一侧肩胛亦可萌发产生初生芽管，形成长圆形的附着胞（图2D），12 h 后附着胞与叶面接触一侧或顶端萌发形成侵染钉（图2C），并开始侵入叶片组织，有的分生孢子另一端肩胛处萌发长出芽管，芽管生长到一定长度侵入组织获取营养，形成拱状菌丝，每个拱状菌丝基部（图2C-Rt）侵入寄主组织产生吸器；24 h 分生孢子芽管基部直接长出初生菌丝（图2D），随着初生菌丝的生长，分生孢子逐渐由饱满变为扁形，此时芽管生长所需的营养由分生孢子提供；48 h 后各菌丝形成分枝，产生次生菌丝（图2E），表明白粉菌开始通过吸器吸收营养，亦表明白粉菌和寄主成功建立寄生关系；96 h 后，大量菌丝网状交织（图2F），此时叶片表面已经开始显症，可以观察到白色粉层；144 h 后菌丝层变厚，显微观察菌丝每隔51.79～77.68 μm 形成一个直立的孢子梗（图2G）；孢子梗继续生长，168 h 后，每个孢子梗串生2～3 个分生孢子，向基性成熟脱落（图2H），解剖镜下观察分生孢子梗排列整齐，长度基本一致（图2I）。

图2 白粉病菌在白三叶草叶片的发育情况Fig.2 Development of E.pisi in T.repens

2.3 白三叶草感染白粉病菌的组织病理变化和细胞超微结构观察

观察初显症（接种白粉菌4 d）白三叶草叶片的组织切片（图3B），清晰看到叶片表皮细胞表面附着大量的菌丝（Hp），且菌丝已经侵入寄主的表皮细胞形成吸器（Hs），表明此时白粉病菌已经通过吸器吸收寄主营养供菌丝生长，而在栅栏组织和海绵组织均未观察到侵入菌丝。正常的白三叶草组织结构完整（图3A），栅栏细胞排列整齐，海绵细胞排列紧密，维管束发达；而受到白粉病菌侵染的栅栏组织和海绵组织细胞排列疏松，且维管束萎缩，但是整体结构尚完整，表明侵染早期，白粉病菌对寄主组织结构的破坏性较小。

图3 正常白三叶草寄主组织与受白粉病菌侵入寄主组织的半薄切片Fig.3 A semi-thin section of normal T.repens host tissue and powdery mildew invaded the host tissue

超微结构观察发现，白粉病菌菌丝内含有细胞核（Nu）、大液泡（Bv）、囊泡（Ve）、线粒体（Mi）和核糖体（Ri），部分线粒体及多个囊泡排列于细胞质膜内侧（图4A，B），菌丝一侧形成凸起进行延长生长且顶端边缘具有膜性物（图4A，C）；菌丝有隔且内有大量的液泡聚集，细胞核临近菌丝顶端（图4D，E），分析可能是随着菌丝生长，大量液泡产生压力将细胞核和线粒体推向菌丝顶部；同时观察到白粉菌菌丝侵入寄主前，与寄主接触部位的表皮细胞细胞壁加厚，颜色加深，对应的细胞内侧略凹陷（图4F），寄主响应病原菌侵染形成的此种结构可能是细胞壁抵御病菌侵入产生的反应，也可能是病原菌侵入诱导寄主产生的反应。菌丝通过保卫细胞和表皮细胞交界处，以直接侵入方式侵入寄主细胞壁，侵入寄主细胞壁组织的菌丝顶端膨大，中间有一近圆形的电子致密度高的区域，该区域向菌丝顶端辐射分布多个小的囊泡和颗粒状物，被侵染的寄主细胞壁组织被降解，且颜色加深，邻近的气孔通道变形，保卫细胞内发生质膜分离现象（图4G），但并未观察到侵入结构。与侵入菌丝对应的表皮细胞内侧形成电子致密度较高的胞壁沉积物，细胞壁和质膜不再完整（图4H，I），而表皮细胞内的胞壁沉积物可能是病原菌诱导寄主产生病程相关蛋白，也可能是寄主的病理反应；同时还观察到表皮细胞内形成了吸器（图4J）；吸器被寄主原生质膜包裹将吸器与寄主细胞质隔开，使吸器与寄主质膜间构成了一个较大的交界面，吸器细胞壁外被一层较厚的膜包围（图4J，K），吸器内充满颜色较深的物质，且颜色明显重于菌丝细胞，但是没有观察到液泡。从试验结果可充分看出吸器和菌丝细胞内的细胞器、细胞质物质明显不同，吸器与质膜间的交界面很可能是病菌与寄主间识别、营养物质交换的场所，而吸器外膜很可能是吸器为了抵御寄主分泌物的破坏。随着病原菌通过进一步侵入和扩展，栅栏细胞内部叶绿体细胞器肿胀，聚集，呈球形，有的叶绿体已被破坏，基粒片层不明显，随着叶绿体变形程度的增加，细胞内的嗜锇颗粒增多（图4L）；没有聚集的叶绿体肿胀，与细胞质膜分离，分离区域充满颗粒状物，淀粉粒由长条形变为椭圆形或三角形，嗜锇颗粒增多、基粒片层等结构发生了明显的变化（图4M）；正常的叶绿体细胞呈梭形，紧贴于细胞质膜，内部可见淀粉粒，嗜锇颗粒、基粒片层清晰，叶绿体膜完整（图4N）；正常的白三叶草表皮细胞细胞壁较厚，气孔通道和保卫细胞结构完整（图4O）。

图4 病原菌侵入寄主细胞的超微结构特征Fig.4 Ultrastructural characteristics of pathogen invading host cells

2.4 白粉菌形态学观察

形态特征观察结果表明：白三叶草白粉病菌分生孢子呈椭圆形或卵圆形，大小为（12.41～24.52）μm×（25.95～45.02）μm，平均大小为17.36 μm（标准差standard deviation，SD=2.20）×34.16 μm（SD=3.93）（图5A）。叶片上观察到的分生孢子梗直立，每个孢子梗串生2～3 个分生孢子，分生孢子梗长度为（6.64～12.46）μm×（21.94～59.48）μm，平均长度为9.95 μm（SD=1.58）× 46.19 μm（SD=9.00）（图5B）。在水琼脂玻片上观察到分生孢子萌发产生的芽管较长，芽管顶端略膨大，中部下方凸起形成侵入结构（图5C），在叶片上观察到分生孢子萌发产生芽管，芽管顶端膨大形成椭圆形的附着胞，附着胞大小为（3.27～7.82）μm×（6.51～13.66）μm（图5D）。形态特征与《真菌鉴定手册》［23］和《中国真菌志第一卷·白粉菌目》［24］中豌豆白粉菌描述基本一致，隶属子囊菌亚门真菌（Ascomycotina）。

图5 白三叶白粉病病原菌的形态特征Fig.5 Morphological characteristics of fungus causing powdery mildews on T.repens

2.5 白粉菌的分子鉴定

经过PCR 扩增，分别获得了2 个菌株BF1和BF2的ITS 序列长度分别为681 和696 bp（图6），将BF1、BF2与Genbank 中已知序列进行Blast 比对分析，发现BF1、BF2与豌豆白粉菌同源性均达到99%。系统发育树显示BF1和BF2与豌豆白粉菌（登录号为KY661145.1 和KY661137.1）在同一分枝（图7）。本研究认为，BF 菌株为豌豆白粉菌。

图7 ITS 序列构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree constructed by ITS sequence

2.6 白粉菌分生孢子生物学特性观察

由表1可知，分生孢子对温度适应范围较宽，在5～30 ℃均可萌发，4 h开始萌发，24 h 时，15、20 和25 ℃萌发率分别达到40.47%、35.85%、47.53%。表明25 ℃最适白粉菌分生孢子萌发。而5 ℃条件下，4 h基本不萌发，24 h 时萌发率仅为7.55%。各时间段萌发增长率不一，25 ℃萌发增长率在4～6 h 最高。

表1 不同温度对白三叶草白粉菌分生孢子萌发的影响Table 1 Effects of different temperatures on the conidia germination of powdery mildew in T.repens

不同光照条件的试验结果表明（表2），4 h 时全光照处理萌发率最大为20.06%，其次是光暗交替，最小是全黑暗为8.33%，全光照与全黑暗在4 h 时有显著性差异，6、8、12 和24 h 萌发率无显著差异，但全光照萌发率整体高于全黑暗，表明光照条件有利于白粉病菌分生孢子的萌发。

表2 不同光照对白三叶草白粉菌分生孢子萌发的影响Table 2 Effect of different lights on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

不同pH 对分生孢子萌发的试验结果表明（表3），pH 4.0～9.0 时分生孢子均可萌发，在萌发24 h 时pH 6.0～8.0 之间萌发率无显著性差异，pH 7.0 为最适，萌发率达到45.50%，pH 4.0 萌发率最低，仅为15.78%，4 h 时pH 6.0 和pH 7.0 萌发率具有极显著差异，说明在中性或略偏酸性条件更适宜分生孢子萌发。

表3 不同pH 对白三叶草白粉菌分生孢子萌发的影响Table 3 Effects of different pH on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

3 讨论

利用光学显微镜及透射电镜观察白粉菌在寄主表皮细胞的发育情况及侵染方式是研究白粉菌与白三叶草互作机理的重要内容。Bushnell［25］观察白粉菌侵入小麦表皮组织发现，接种白粉菌13 h 后，在表皮组织内观察到了吸器结构的形成。本试验观察白粉病菌侵染白三叶草叶片12 h 时附着胞一侧形成侵染钉，形成吸器侵入寄主组织。研究结果与麦类白粉菌（Erysiphe graminis）［25］以及橡胶树白粉病菌（Oidium heveae）［26］侵染寄主的研究结果基本一致。通过菌丝生长过程发现，分生孢子前期自身提供营养促使菌丝生长，待菌丝顺利侵入寄主，分化出大量次生菌丝，此时分生孢子已不能满足菌丝生长条件，而是通过吸器吸收寄主营养进行生长，此时表明白粉菌与寄主成功建立了寄生关系。张咏梅等［27］研究发现紫花苜蓿受白粉菌侵染后，叶片的栅栏组织结构变形，可进行光合作用的叶肉细胞增多。本试验无论是栅栏组织细胞还是海绵组织中均未观察到有菌丝侵染，虽然栅栏组织细胞结构尚完整，但是细胞排列疏松，尤其是栅栏组织细胞内的叶绿体肿胀变形聚集，分析认为可能是病原菌分泌了降解酶破坏了叶绿体膜和类囊体膜，导致叶绿体瓦解。叶绿体结构的完整性是保障植物进行光合作用的基础［28］，淀粉粒和嗜锇颗粒数量的变化是维持叶绿体结构稳定的一种动态调节机制。研究表明，叶绿体结构被破坏时，光合作用合成的糖类输出受阻或产量降低而迅速转化为淀粉，导致淀粉在叶绿体中大量累积形成淀粉粒［29］，而嗜锇颗粒是类囊体膜的动态脂质库，当类囊体膜中脂质过高嗜锇颗粒就会吸收变多［30］。Van Wijk 等［31］认为类囊体膜解体与嗜锇颗粒超量化有着很强的相关性，当植物暴露于干旱或高光时嗜锇颗粒迅速增加，胁迫解除后嗜锇颗粒减小。刘敏等［32］在研究葡萄（Vitis vinifera）叶片受高温胁迫后叶绿体超微结构变化发现，叶绿体膨胀，叶绿体膜解体，淀粉粒和嗜锇颗粒增多变大。徐威等［33］在研究NaCl 胁迫对白三叶草叶片超微结构变化发现，在低盐胁迫下，叶绿体开始变形，基粒片层松散变形，淀粉粒与嗜锇颗粒增多。本试验观察到白粉病菌侵入白三叶寄主细胞，破坏叶绿体细胞，导致淀粉粒变形数量增多，而嗜锇颗粒数量随着叶绿体细胞变形程度的增加而增加，与前人研究结果一致，亦充分表明，淀粉粒和嗜锇颗粒是叶绿体应对生物或非生物胁迫的一种响应机制。史娟等［34］认为苜蓿假盘菌定殖在苜蓿叶片内的病菌菌丝，首先破坏的细胞器是叶绿体。苜蓿褐斑病引起牧草质量下降和光合速率降低，从细胞学角度揭示了感病苜蓿品质下降的生理学机制。感病白三叶草的品质是否会受到影响需要进一步研究阐明。本试验同样观察到已侵入与未侵入寄主的菌丝结构存在一定差异，未侵入寄主的菌丝顶端存在线粒体结构，而已侵入寄主的菌丝顶端存在一近圆形的电子致密物，二者顶端结构的差异，亦可能造成二者的生长机制与侵染方式存在差异。

豌豆白粉菌隶属于白粉菌目真菌，主要寄生于黄芪（Astragalus membranaceus）、苜蓿、草木樨（Melilotus officinalis）、豌豆（Pisum sativum）、蚕豆（Vicia faba）等豆科植物上［24］。国内外对白三叶草白粉病的相关研究较少，而陈曙晖等［35］依据红三叶草白粉病菌丝寄生于寄主表面，分生孢子无色呈椭圆形串生于孢子梗顶端，大小为（13～16）μm×（24～33）μm 等形态学特征，将贵州人工草场红三叶草白粉病病原菌鉴定为半知菌亚门粉孢霉属白粉粉孢霉菌（Oidium erysiphoides），有性阶段为蓼白粉菌。燕勇等［36］认为将ITS 序列分析结果与传统形态学鉴定结果相结合能更准确地鉴定真菌。由于尚未发现白三叶草白粉病菌的有性态，因此，利用无性态结构特征，结合分子生物学鉴定亦是确定病原菌有效的办法。本试验通过观察白三叶草白粉菌分生孢子、分生孢子梗、芽管及附着胞的形态和大小等形态学特征，并与《真菌鉴定手册》［23］和《中国真菌志第一卷·白粉菌目》［24］进行对照。同时对白粉菌菌株进行分子生物学鉴定，认为宁夏地区白三叶草白粉病由子囊菌亚门豌豆白粉菌侵染所致。

生物学试验结果表明白粉菌在5～30 ℃均可萌发，25 ℃为最佳，全光照条件及中性或略偏酸性条件更适宜分生孢子萌发。宁夏坐落于西北内陆、气候干旱、日照时间长［37］，降水量少且集中于6-9月，该气候特点与病原菌的生物学特性相吻合，可为田间确定防治时间提供依据。

4 结论

白粉菌侵染白三叶草叶片12 h 时附着胞一侧形成侵染钉，侵入寄主组织形成吸器，被白粉病菌侵染的白三叶草叶片，表皮细胞的细胞壁被降解、气孔通道变形，叶绿体肿胀，淀粉粒和嗜锇颗粒增多，显示出白粉病菌侵染白三叶草破坏叶绿体的一种侵染机制，而白粉病菌实施了何种侵染策略有待于深入研究。依据传统形态学特征，结合ITS 序列分析将宁夏地区白三叶草白粉病的致病菌鉴定为豌豆白粉菌。