高玉莲，常静，王贻卉，李锋，李海平*，马崇勇

（1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特010019；2.内蒙古自治区草原工作站，内蒙古 呼和浩特010020）

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）为瑞香科（Thymelaeaceae）狼毒属（Stellera）多年生草本植物，民间又称红狼毒、馒头花、绵大戟等，广泛分布于我国干草原、沙质草原和典型草原的退化草地上［1］。 瑞香狼毒全株有毒，是严重危害我国草原生态的毒杂草之一。与草原其他植物相比，瑞香狼毒对恶劣环境有更好的适应性，侵占性和竞争性也很强，这些特点使其在某一植物群落中更具竞争力，因此随着草原的退化，瑞香狼毒成为群落中的优势种，与牧草争夺空间和资源，牧草产量逐渐下降［2-3］。另外，瑞香狼毒还通过化感作用影响其他植物，对草地植物种的消长起重要作用［4-6］。据不完全统计，内蒙古通辽市阿鲁旗形成了以瑞香狼毒为主要植物群落的草场约4 万hm2，有瑞香狼毒生长的草场约13.3 万hm2，占全旗草场面积的28%［7］。在内蒙古乌兰察布草原，狼毒已经成为退化草地的“景观植物”。瑞香狼毒在甘肃省危害面积54.67 万hm2，严重危害面积34.67 万hm2，占全省毒草危害面积的31.12%［8］。近年来瑞香狼毒扩散面积和强度不断增加，对畜牧业和生态系统的危害日趋严重。张宝琛等［9］研究发现，植物间的化感作用可能是导致高寒草甸人工草场退化的重要原因。王文婷等［10］研究预测，未来气候变化下高寒草地将成为未来狼毒扩散的主要区域。

瑞香狼毒的强侵占性和竞争性使其在草原上大肆蔓延，严重影响草原生态环境和畜牧业的发展。因其全株有毒，误食易引起家畜中毒，目前主要采用人工挖除、化学灭除等方法防除瑞香狼毒，但这些防控方法又会造成水土流失、环境污染等问题。因此，合理利用瑞香狼毒、控制其发生蔓延在草原保护中就显得尤为重要。化感作用（allelopathy）是植物种间关系的重要类型之一，关于瑞香狼毒的化感作用已有很多的研究成果，瑞香狼毒茎、叶、根系的分泌物和提取物均对其他植物的种子萌发和幼苗生长有不同程度的抑制作用［11-13］。但这些研究多集中在瑞香狼毒对草原主要牧草的化感作用上，若能利用瑞香狼毒化感作用的特性开发除草剂，对未来瑞香狼毒资源的合理开发利用将非常有利。一般测定植物之间化感作用常采用生物测定法，测定对象通常采用反应敏感、生长整齐的作物种，如黄瓜（Cucumis sativus）、油菜（Brassica campestris）、小麦（Triticum aestivum）、高粱（Sorghum bicolor）等［14］。因此，本研究选取了高粱、小麦、燕麦（Avena sativa）3 种禾本科作物，研究瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物种子萌发及幼苗生长状况的影响，以及对3 种作物防御酶活性及丙二醛含量的影响，为未来合理利用瑞香狼毒资源，开发植物源除草剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物瑞香狼毒根于2018年8月采自内蒙古乌兰察布市四子王旗草原，取回洗净阴干。受试作物高粱、小麦、燕麦种子，由内蒙古农业大学农学院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 瑞香狼毒根提取物的制备 用小型粉碎机（永康红太阳机电有限公司，浙江）将阴干的瑞香狼毒根粉碎后过0.425 mm 筛，按瑞香狼毒根粉末与70%乙醇比为1∶8 的比例加入乙醇，浸泡72 h 后过滤，将提取液置于旋转蒸发仪（上海比朗仪器有限公司，上海）上，恒温65 ℃蒸去大部分乙醇，将剩余提取物取出自然挥干至膏状。保存在4 ℃冰箱备用。

1.2.2 瑞香狼毒根乙醇提取物对种子萌发的影响

采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验［15］。挑选饱满、无虫害的受试植物种子，用75%的乙醇、3%次氯酸钠依次进行消毒，再用蒸馏水冲洗数次，用滤纸吸干表面水分，置于铺有两层滤纸的培养皿（直径12 cm）中，每皿放置种子30 粒，分别加入不同浓度的瑞香狼毒根乙醇提取液5 mL（取少量乙醇溶解提取物后用蒸馏水将提取物分别稀释为0.01、0.5、2.5、5、10 和25 mg·mL-1），以蒸馏水处理为对照，在培养箱中培养，温度为（25 ± 1）℃，每个浓度处理100 粒种子，3 次重复。每24 h 观察记录萌发种子数（胚根突破种皮1 mm 视为萌发），发芽末期连续2 d无萌发时视为发芽结束。根据慕小倩等［16］的方法计算发芽率。

发芽率=终期发芽总数/供试种子数×100%

数据统计分析采用Williamson 等［17］提出的化感效应检验方法，即：RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T＜C)，其中C为对照值，T为处理值，RI为化感作用效应，RI＞0 为促进，RI＜0 为抑制，绝对值的大小表示作用强度大小。

化感综合效应指数（synthetical effect of allelopathy，SE）反映化感效应的强弱，是指同一处理下对同一受体各测试项目（发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、苗高、根长）对照抑制百分率的算术平均值。

1.2.3 瑞香狼毒根提取物对作物幼苗生长的影响

作物幼苗生长至第8 天，各浓度处理分别取长势良好的10 株幼苗进行茎、根长测量，每个处理记录10 个测量值并求其平均数。测量时，以根与茎的交界处为起点，将尺子顺着作物主茎量到生长点（顶部），即为幼苗的株高；以根与茎的交界处为起点，一直到主根最底端，即为幼苗主根根长；根茎长测量均重复3 次。

1.2.4 幼苗生理指标的测定 1）丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定：参照李合生［18］实验方法。取0.5 g 叶片，加5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得匀浆在3000 r·min-1下离心10 min。取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后在100 ℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450、532 和600 nm 处的吸光度值，并按公式算出MDA 浓度，再算出单位鲜组织中的MDA 含量，单位为mmol·g-1FW。

2）过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定：采用愈创木酚法［18］。取0.5 g 叶片加入5 mL 磷酸缓冲液（pH 7.0，0.1 mol·L-1），冰浴下碾磨匀浆，匀浆液于4 ℃5000 r·min-1离心15 min，上清液即为POD 粗酶液。吸取0.1 mL 酶液加入2.5 mL 愈创木粉-H2O2混合溶液，于470 nm 下测量吸光度。每隔30 s 读一次，连续读3 min，以磷酸缓冲液（PBS）替代粗酶液作为空白对照。以吸光度每分钟变化0.10 为一个活力单位，单位为U·g-1·min-1。

3）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定：采用NBT 法［18］。取0.5 g 叶片加入5 mL PBS（pH 7.8，0.05 mol·L-1），冰浴碾磨后于4 ℃10000 r·min-1离心15 min，上清液即为粗酶液。在试管中加入甲硫氨酸（Met）（终浓度为13 mmol·L-1）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）（终浓度为10 μmol·L-1）、氮蓝四唑（NBT）（终浓度为75 μmol·L-1）、核黄素（终浓度为2 μmol·L-1）和酶液并定容至3 mL，另取2 支对照管以缓冲液代替酶液。将上述对照管和1 支测定管置于4000 lx 光照下反应20 min。用遮光的对照管为空白对照。以NBT为底物，以抑制NBT 光化还原50%为一个酶活性单位，单位为U·g-1FW·h-1。

4）过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定：采用紫外吸收法［18］。取0.5 g 叶片加入5 mL PBS（pH 7.0，0.05 mol·L-1），冰浴下碾磨匀浆，匀浆液于4 ℃15000 r·min-1离心15 min，上清液即为CAT 粗酶液。在3 mL 反应体系中，按一定比例加入Tris-HCl 缓冲液、蒸馏水以及酶液，之后在25 ℃水浴中预热3 min 后，逐管加入0.2 mL 200 mmol·L-1H2O2溶液，于470 nm 下测量吸光度。每隔30 s 读一次，连续读3 min，以PBS 替代粗酶液作为空白对照，以1 min 内A240降低0.10 为一个酶活性单位（U），单位为U·g-1FW·min-1。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 软件对数据进行处理和绘图，采用软件SPSS 20.0 对试验数据进行方差比较和显著性分析，其显著水平设P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 瑞香狼毒根乙醇提取物对不同作物种子发芽的影响

在瑞香狼毒根乙醇提取物不同浓度作用下，高粱种子发芽率均低于对照，但差异不显著。瑞香狼毒根乙醇提取物浓度为25 mg·mL-1时，小麦种子的发芽率与对照相比差异显著，其余浓度下差异均不显著。瑞香狼毒根乙醇提取物对燕麦种子的发芽率呈现“低促高抑”的浓度效应，但与对照相比差异不显著（表1）。

表1 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物种子发芽的影响Table 1 Effects of ethanol extracts from S.chamaejasme root on seed germination of three crops

2.2 瑞香狼毒根乙醇提取物对不同作物幼苗生长的影响

随着瑞香狼毒根乙醇提取液浓度的增加，高粱根长与茎长呈现“低促高抑”的浓度效应。当提取液浓度为0.01 mg·mL-1时，与对照相比根长促进了14.01%，差异显著；其余浓度下高粱根长受到抑制。当提取液浓度为0.5、0.01 mg·mL-1时，高粱茎长分别增加了8.84%和9.76%，但与对照差异不显著，而其余浓度下茎长受到抑制，与对照及低浓度之间差异显著（图1）。

图1 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物根茎长的影响Fig.1 Effects of ethanol extract from S.chamaejasme root on root and stem length of three crops

不同浓度瑞香狼毒根乙醇提取液对小麦根、茎长度均起到抑制作用，浓度越大抑制程度越强。浓度为0.01 mg·mL-1时对小麦根茎长抑制作用最弱，较对照降低了9.34%和16.72%。浓度为25 mg·mL-1时对小麦根茎长抑制作用最强，抑制率为92.49%和73.10%。

当瑞香狼毒根乙醇提取液浓度为0.01 和0.5 mg·mL-1时，对燕麦根茎长有促进作用；而其他浓度对燕麦根茎长均产生了抑制作用，浓度越大抑制越强。在浓度25 mg·mL-1时产生的抑制作用最大，抑制率为93.13%和60.65%，总体呈现出“低促高抑”的浓度效应。

2.3 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种禾本科作物化感综合效应的影响

为了综合分析瑞香狼毒根乙醇提取液对3 种禾本科作物种子萌发和幼苗生长发育的化感效应，统计3 种植物的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗根长、幼苗茎长6 个指标的化感效应指数，计算出化感综合效应指数（表2）。随着瑞香狼毒根乙醇提取液浓度的升高，高粱、燕麦表现为“低促高抑”的双重效应，浓度为0.01 和0.5 mg·mL-1时对高粱、燕麦表现为促进作用，高于0.5 mg·mL-1时表现为抑制作用；二者均随着浓度的升高抑制作用逐渐增强。瑞香狼毒根乙醇提取物对小麦表现出抑制作用，浓度越大抑制程度越强。在瑞香狼毒根乙醇提取液浓度范围内（0.01～25 mg·mL-1），对3 种禾本科作物的抑制作用强弱顺序为：小麦＞燕麦＞高粱。

表2 瑞香狼毒根提取物对3 种作物的化感综合效应Table 2 Allelopathy of S.chamaejasme root extract on three crops

2.4 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物幼苗丙二醛（MDA）含量的影响

瑞香狼毒根乙醇提取液对3 种作物MDA 含量的影响（图2）。瑞香狼毒根乙醇提取液处理后，高粱MDA 含量增加，提取液浓度为5、10 mg·mL-1时MDA 含量与对照有显著差异。在浓度为5 mg·mL-1时，小麦MDA 含量显著高于对照，浓度为0.01、25 mg·mL-1时，小麦MDA 含量显著低于对照，其余处理与对照无显著差异。提取液处理后燕麦MDA 含量增加，不同浓度处理与对照相比均有显著差异。

图2 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物丙二醛含量的影响Fig.2 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on malondialdehyde（MDA）content in three crops

2.5 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物幼苗过氧化物酶（POD）活性的影响

瑞香狼毒根乙醇提取液处理使3 种作物体内POD 活性较对照均有不同程度的升高。高粱幼苗中POD 活性随浓度的增大而升高，在浓度为10 mg·mL-1时POD 活性最高，比对照增大了116.29%。小麦幼苗中POD 活性在0.01、0.5 和10 mg·mL-1下与对照差异显著，其余浓度下的POD 活性与对照均无显著差异；不同浓度处理燕麦幼苗中POD 活性均显著高于对照，在浓度为0.01 mg·mL-1时POD 活性最大（图3）。

图3 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物过氧化物酶活性的影响Fig.3 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on peroxidase（POD）activity in three crops

2.6 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

加入瑞香狼毒根乙醇提取液处理后，高粱SOD 活性增加，但与对照无显著差异。小麦SOD 活性在提取液高浓度（10 和25 mg·mL-1）处理下显著高于对照，其他处理与对照无显著差异。在提取液浓度为0.01 mg·mL-1时，燕麦SOD 活性显著高于对照，其余浓度与对照无显著差异（图4）。

图4 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物超氧化物歧化酶活性的影响Fig.4 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on superoxide dismutase（SOD）activity in three crops

2.7 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物过氧化氢酶（CAT）活性的影响

瑞香狼毒根乙醇提取液对3 种作物体内CAT 活性的影响（图5）。加入提取液后，3 种作物体内CAT 活性均低于对照。处理浓度为25 mg·mL-1时，3 种作物CAT 活性均最低，分别为对照的0.33、0.31、0.37 倍，与对照存在显著差异（图5）。

图5 瑞香狼毒根乙醇提取物对3 种作物过氧化氢酶活性的影响Fig.5 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on catalase（CAT）activity in three crops

3 讨论

化感作用普遍存在于自然界，是植物长期自然选择的结果，也是植物提高自身生存能力的重要手段之一，其在优势种的形成、群落演替、植被恢复中起着重要的作用［19］。研究表明，植物化感作用的强度与浸提液浓度、化感物质种类及受试植物种类有关［20］。

植物产生的化感物质释放到环境中，可抑制或促进自身或其他植物各个阶段的生长发育［21］。种子萌发对物种更新至关重要，种子发芽率降低会使植物的竞争力减弱，影响植物在自然群落中的多度，进而影响群落结构，最终导致生态系统退化［22-23］。本研究中，瑞香狼毒不同浓度提取物降低了高粱种子的萌发率，但与对照相比均不显著，此结论与冯娜［24］研究狼毒叶提取物对黍子（Panicum miliaceum）萌发影响的结果一致。瑞香狼毒提取物在低浓度时促进了小麦和燕麦种子的萌发率，但不显著，随着浓度的升高逐渐抑制了种子的萌发率，这一结论与刘雅婧等［13］在研究狼毒浸提液对3 种牧草种子萌发的影响中得出的结论相符。说明不同受试植物的种子对狼毒提取液的敏感性不同，狼毒对3 种受体作物的化感作用具有物种选择性及浓度依赖性［25］。

幼苗阶段对于植物生长至关重要，植物在幼苗阶段从外界充分吸收营养物质供生存和繁衍。季丽萍［11］的研究表明，高浓度瑞香狼毒根水浸液对紫花苜蓿（Medicago sativa）、黑麦草（Lolium perenne）的株高和根长有明显抑制作用，且根长较株高受抑制作用更大。本研究也有相似结论，瑞香狼毒提取液低浓度处理促进了高粱、燕麦的根长和茎长，高浓度下抑制；小麦随着提取液浓度的升高，根、茎长的抑制作用逐渐增大。这些结论表明，瑞香狼毒浸提液中的某些化感物质对受试植物向外界吸收营养物质产生了阻碍，从而影响受试植物的幼苗生长。且相同浓度浸提液对根长的抑制作用明显大于茎长，造成这一现象的原因，Turk 等［26］和Chon 等［27］认为，植物根系直接接触到浸提液，受到化感抑制的时间更长，而叶片靠根部运输养分，只有当根系受到化感胁迫到一定程度时，叶片才会表现明显的响应。

一般来说，植物体内活性氧的产生和清除之间处于动态平衡。逆境胁迫下植物体内会产生大量的活性氧自由基，此时保护酶活性增强或维持较高的水平，才能清除活性氧自由基，使之维持较低的水平，防止自由基对生物膜结构和功能的破坏［28］。丙二醛（MDA）是生物膜系统脂质过氧化的产物之一，其含量高低指示膜脂过氧化强度和膜系统的受损程度。本研究表明，在瑞香狼毒根提取物的作用下，受试作物MDA 含量随着提取液浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，几乎均高于对照，说明受试作物体内发生的膜脂过氧化程度强，植物受损程度大，与黄建贝等［29］、曹成有等［30］的研究结果一致。高粱、燕麦在浓度为10 mg·mL-1时MDA 含量达到最高，小麦在浓度为5 mg·mL-1下MDA 含量达到最高，随后作物体内MDA 含量下降，这可能是由于高浓度逆境胁迫已使植物受到伤害，无法逆转［31］。过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累最主要的酶，对维护植物的正常生长具有保护作用［32］。本试验中，瑞香狼毒根提取液处理受试作物后，3 种作物幼苗POD 活性均高于对照，与李翔等［33］在黄花棘豆（Oxytropis ochrocephala）水提液对燕麦的化感作用及其机理研究中所得结果相符。POD 活性的增加一方面有利于清除体内的活性氧，另一方面参与细胞壁多种结构成分的聚合，使植物细胞伸展性下降，从而限制植物细胞伸长［34］。高粱、小麦幼苗中SOD 活性随提取液浓度增大逐渐升高，这可能是因为在瑞香狼毒根乙醇提取液处理下，抗氧化酶活性升高作为其体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加的一种应急机制；而燕麦幼苗中SOD 活性在低浓度下促进，高浓度下抑制，这可能是在高浓度处理下，受体作物体内的ROS 代谢失调，从而导致抗氧化酶活性降低［35］，这与张金羽等［36］的研究结果相似。黄建贝等［29］在核桃（Juglans regia）凋落叶对小麦的影响中发现，随着凋落叶浓度的增加小麦体内CAT 活性显著低于对照，本试验中，瑞香狼毒根提取液处理后3 种作物幼苗CAT 活性均低于对照，与他们的结论一致。

瑞香狼毒是退化草原上重要的多年生毒杂草，随着草原生态环境的恶化有不断蔓延扩散的趋势，对草原生态系统影响极大。本研究通过其对3 种指示作物种子发芽、幼苗生长的影响及其影响机制的研究，为未来合理利用瑞香狼毒、开发植物源除草剂提供一定的科学依据。利用瑞香狼毒对其他植物的化感作用将其开发成新型的植物源除草剂，不仅可以节约草原毒害草的治理成本，还可以减少水土流失，有效遏止草原荒漠化的蔓延趋势，提高草原生态的恢复能力。对提升当地瑞香狼毒资源的有效利用，变害为利、变废为宝，改善生态环境具有重要的意义。