王如月，袁世力，文武武，周鹏，安渊

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，适口性好，营养价值高，富有“牧草之王”的美称。紫花苜蓿在我国的栽培历史长达两千多年，近年来随着我国畜牧业发展规模和水平的不断提高，紫花苜蓿种植面积不断扩大，主要种植在北方地区，南方种植面积相对较小。究其原因主要是南方土壤多呈强酸性［1］，而紫花苜蓿适宜生长在弱酸性环境（6.5～7.5）中，当土壤pH 小于4.5 时，紫花苜蓿的生长受到明显的抑制，从而限制了紫花苜蓿在南方大面积种植。李剑峰［2］的研究表明，如果单纯考虑土壤酸度，紫花苜蓿适宜生长的pH 为5。由此可看出，酸性土壤中影响紫花苜蓿生长的因素不仅仅是pH，还有其他更重要的因素。铝（Al）在地壳中的含量仅次于氧和硅，是含量最丰富的金属元素，占地壳总量的7.5%［3］。一般情况下，土壤中的铝以铝硅酸盐化合物或氧化物的形态存在［4］，植物难以吸收。当土壤pH 值低于5.5 时，固相态铝释放到土壤中以交换性铝离子的形态存在［5］，从而对植物产生毒害作用。铝对植物的伤害是多方面的，典型的特征是根伸长和根毛形成受到抑制［6］，从而降低根系吸收水分和营养物质的能力，导致光合作用减弱，影响植物生长［7］。酸性土壤中Al3+浓度的增加会与其他阳离子竞争根表面质膜的结合位点，从而影响营养元素的吸收，间接造成植物营养缺乏［8］。有研究发现铝可以抑制黑麦（Secale cereale）、小麦（Triticum aestivum）［9］根系对磷的吸收，导致缺磷症的发生。原因是铝离子易与土壤中的磷形成不溶于水的AlPO4，从而降低土壤溶液中的磷含量［10］。磷（phosphorus，P）是植物生长发育的三大营养元素之一［11］，在酸性土壤中经常施用磷肥，以增加土壤中磷的有效性，降低铝的毒性，例如磷能够缓解水稻（Oryza sativa）［12］、油茶（Camellia oleifera）［13］等的铝毒害，但也有研究认为铝胁迫下水稻根系分泌磷酸盐并不能缓解铝对水稻的毒害［14］。磷缓解植物铝毒害的作用可能因物种和栽培方式的不同而不同。

我国长江以南的酸性土壤地区有着适宜的温度和充足的水分，可为牧草生长提供良好的生长环境，研究紫花苜蓿对酸铝环境的适应机制，对我国南方紫花苜蓿种植以及畜牧业持续健康发展有着重要的现实意义。本研究以铝敏感型紫花苜蓿‘Wl440’为材料，通过水培方式研究磷对紫花苜蓿铝毒的缓解效应，初步探究磷缓解紫花苜蓿铝毒的机理，以期为南方紫花苜蓿栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为铝敏感型紫花苜蓿‘Wl440’，由北京正道有限公司提供。2018年1月将种子用蒸馏水冲洗干净后均匀撒在浸透蒸馏水的滤纸上，并用保鲜膜封好，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚）、光强4000 lx，光照14 h 的人工气候室中萌发培养。每天补充适量蒸馏水，确保种子浸润。6 d 后选取健康且长势一致的幼苗，在茎基部用海绵包裹，固定在12 孔的泡沫板上，每孔固定6 株幼苗，置于1/2 Hoagland 营养液（pH=5.8）培养4 d，作为试验用苗。

1.2 试验设计

设置CK（空白对照）、P（磷）、Al 和Al+P 4 个处理，其中，对照（CK）：将幼苗置于简易［Ca（NO3）2］营养液（pH=4.5）中培养，营养液每2 d 更换一次。培养环境：温度为25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光强为4000 lx，光照时长为14 h，相对湿度为60%；磷处理（P）：在对照处理的基础上，每升营养液中加入200 μmol·L-1KH2PO4，该磷浓度由预实验获得；铝处理（Al）：在对照处理的基础上，每升营养液中加入100 μmol·L-1的AlCl3；铝加磷处理（Al+P）：在铝处理的基础上，每升营养液中加入200 μmol·L-1的KH2PO4。将各处理K+浓度补平至200 μmol·L-1，使各处理K+浓度相同，用盐酸调节pH 至4.5。每个试验处理均设置3 次重复，每个重复72 株苗。处理3、7 和10 d取样，进行指标测定。

1.3 测定方法

根长测定：采用每3 株幼苗为一个重复，用直尺测量其根长，计算平均值，作为一次重复。参照Dacosta 等［15］的方法测定叶片电导率；采用硫代巴比妥酸（TBA）法［16］测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［17］测定根系活力。采用乙醇：丙酮法［18］测定叶绿素含量。以上叶片均取顶部第1～2 个复叶。铝含量测定：处理7 d 的幼苗取样烘干后分别准确称取叶片和根约0.1 g 左右，置于50 mL 离心管中，加入3 mL HNO3和1 mL H2O2，消煮2 h。静置过夜后取上清液，用电感耦合等离子体发射光谱仪（Optima 8000，铂金埃尔默）测定铝含量。各指标测定重复3 次。

光合气体交换参数测定：用GFS-3000 光合荧光测定系统（WALZ，德国）测定光合气体交换参数，包括净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）。将GFS-3000 光合仪预热30 min 后设置测量参数，然后将Flow 设为750，Imp.为7。根据叶室面积，在Area 设置相应的叶面积。相关参数设置完成后进行ZP调0 和MP 调0，并开始测定。叶室夹上测定样品叶片，观察光合速率A 值稳定后存储数据。每处理重复4 次。

用Imaging-PAM（WALZ，德国）测定光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSII）荧光参数，包括最大荧光（maximal fluorescence，Fm），初始荧光（minimal fluorescence，F0），PSII 光合电子传递速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅡ，ETRII）。用Dual-PAM 100（WALZ，德国）测定光系统I（PSI）荧光参数，主要测定PSI 光合电子传递的相对速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅠ，ETRⅠ）。通过快速光曲线常用拟合方程P=PAR/（a·PAR2+b·PAR+c）［18］（其中，P 为快速光曲线；PAR 为光强）获取拟合参数的公式为α=1/c，。其中α 为快速光曲线的初始斜率，反映了光合器官对光能的利用效率；rETRmax是拟合出来的潜在最大相对电子传递效率；Ik 是初始斜率线和rETRmax水平线的交点在坐标横轴上的投影点，代表了植物半饱和光强，反映植物耐受强光的能力［19-20］。每重复选择3 个叶片，重复4 次。

有机酸测定：配制草酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸标准溶液，利用高效液相色谱做出标准曲线。采用高效液相色谱测定铝处理3、6、12、24 h 后根系有机酸分泌量和铝处理3、7 和10 h 根系有机酸含量。根系有机酸的提取：根据Pellet 等［19］的方法略做修改。称取鲜样0.5 g，放入离心管中，加入3 mL 超纯水，75 ℃水浴提取15 min，在12000 r·min-1、4 ℃下离心30 min，吸取上清液，用微孔滤膜（0.25 μm）过滤，用C-18 Sep Pack 样品过滤柱过滤除去酚类物质和固体颗粒，立即分析或放入冰箱（4 ℃）备用。根系分泌物收集：根据Mucha 等［20］的方法加以修改。将待测样品根系用蒸馏水和超纯水分别清洗5 次和3 次，最后将15 株幼苗的根系置于10 mL 超纯水中，避光浸泡收集根分泌物6 h，然后立即用微孔滤膜过滤并冷冻干燥后，用5 mL 超纯水溶解剩余残渣，分别用C-18 Sep Pack样品过滤柱过滤和微孔滤膜过滤，4 ℃保存备用。色谱条件：Hibar column RT 250 mm×4.6 mm C18柱，填料直径5 μmol·L-1，柱温25 ℃，流动相为1∶1 的0.025 mmol·L-1H2SO4和0.025 mmol·L-1KH2PO4缓冲液，使用前用微孔滤膜（0.25 μmol·L-1）过滤，流速为1 mL·min-1，紫外检测波长210 nm，进样量20 μL。每重复选择3 个叶片，重复4 次。

1.4 数据分析

数据采用SAS 8.1 软件进行方差分析和多重比较（P＜0.05）分析，使用SigmaPlot 作图。

2 结果与分析

2.1 磷对铝胁迫紫花苜蓿根系的影响

铝胁迫显著抑制了紫花苜蓿根系生长，而磷添加则缓解了铝对紫花苜蓿根系生长的抑制作用。与铝处理相比，添加磷处理下的根长分别增加21.95%（3 d）、36.03%（7 d）和44.33%（10 d）（图1a）；铝胁迫显著降低了苜蓿根系活力，依次比对照降低22.10%（3 d）、23.31%（7 d）和31.99%（10 d），施加磷后的根系活力分别比铝处理增加了12.83%（3 d）、16.55%（7 d）和18.06%（10 d）（图1b）。

图1 磷对铝胁迫紫花苜蓿根系生长和活力的影响Fig.1 Effects of phosphorus on root length and activity of alfalfa under aluminum stress

2.2 磷对铝胁迫紫花苜蓿电导率和丙二醛（MDA）含量的影响

铝胁迫显著增加了苜蓿叶片电导率，依次比对照增加22.82%（3 d）、24.91%（7 d）和56.51%（10 d）。磷添加对铝胁迫苜蓿叶片电导率含量有一定降低作用，比铝处理分别降低11.55%（3 d）、9.79%（7 d）和9.99%（10 d）（图2a）。

铝胁迫明显增加了苜蓿叶片的丙二醛（MDA）含量，依次比对照增加20.44%（3 d）、21.14%（7 d）和25.29%（10 d）。磷添加处理明显缓解了铝对叶片细胞膜的伤害，MDA 含量比铝处理分别降低8.49%（3 d）、11.02%（7 d）和11.60%（10 d）（图2b）。

图2 磷对铝胁迫下紫花苜蓿电导率和MDA 含量的影响Fig.2 Effects of phosphorus on the electrical conductivity and MDA content of alfalfa under aluminum stress

2.3 磷对铝胁迫紫花苜蓿叶绿素含量的影响

由表1可知，铝胁迫处理7 和10 d，叶绿素a 的含量显著低于对照，分别降低14.75%（7 d）和18.11%（10 d）。处理第10 天，施加磷显著提高铝胁迫苜蓿叶绿素a 的含量（17.31%）。铝胁迫对叶绿素b 含量的影响较小，对照和施加磷处理之间的差异均不显著。

表1 磷对铝胁迫紫花苜蓿叶绿素含量的影响Table 1 Effect of phosphorus on chlorophyll content of alfalfa under aluminum stress（μg·g-1 FW）

2.4 磷对铝胁迫紫花苜蓿体内铝含量的影响

在CK 和P 处理中，紫花苜蓿根系中的Al 含量非常少，叶片中未检测到Al 存在。磷添加明显降低了苜蓿对铝的吸收，根系和叶片中的铝含量分别比铝处理降低了81.53%和61.47%（图3）。

图3 磷对铝胁迫下紫花苜蓿体内铝含量的影响Fig.3 Effect of phosphorus on aluminum content in root and leaves of alfalfa under aluminum stress

2.5 磷对铝胁迫紫花苜蓿光合参数的影响

铝胁迫显著抑制了苜蓿叶片的蒸腾速率、气孔导度和光合速率，磷添加对铝胁迫苜蓿叶片的蒸腾速率、气孔导度和光合速率产生明显的促进作用（表2）。与铝处理相比，磷添加处理的蒸腾速率分别增加13.81%（3 d）、12.89%（7 d）和12.86%（10 d）；气孔导度分别增加9.48%（3 d）、9.60%（7 d）和12.59%（10 d）；光合速率分别增加12.44%（3 d）、21.08%（7 d）和7.26%（10 d）。铝胁迫显著增加了苜蓿叶片的胞间CO2浓度，依次比对照增加11.44%（3 d）、23.42%（7 d）和25.84%（10 d），而磷添加一定程度减少了铝胁迫苜蓿的胞间CO2浓度，依次比铝处理减少9.24%（3 d）、7.90%（7 d）和9.53%（10 d）。

表2 磷对铝胁迫紫花苜蓿光合参数的影响Table 2 Effects of phosphorus on photosynthetic parameters of alfalfa under aluminum stress

2.6 磷对铝胁迫紫花苜蓿Fv/Fm的影响

铝胁迫抑制了苜蓿最大光能转化效率（图4），荧光成像中，铝胁迫下苜蓿叶片的荧光变浅，说明铝胁迫下苜蓿幼苗叶片最大光能转化效率有所降低。磷添加对铝胁迫苜蓿的最大光能转化效率具有较强的促进作用，荧光强度高于Al 处理。

图4 磷对铝胁迫紫花苜蓿叶片Fv/Fm的影响Fig.4 Effect of phosphorus Fv/Fm of alfalfa leaves under aluminum stress

2.7 磷对铝胁迫紫花苜蓿光系统Ⅱ和光系统I 快速光曲线的影响

铝胁迫抑制了苜蓿光系统Ⅱ和I 的相对电子传导速率，而添加磷明显促进了铝胁迫苜蓿光系统Ⅱ的相对电子传导速率ETRII（图5a）和光系统I 的相对电子传导速率ETRI（图5b），在918 μmol photons·m-2·s-1光强度下，CK、P、Al 和Al+P 处理的ETRII 值分别为14.9、14.5、8.1 和10.5 μmol·m-2·s-1；ETRI 值分别为101.9、93.8、63.9 和76.8 μmol·m-2·s-1，与Al 处理相比，P 添加对ETRII 和ETRI 的增幅分别达到29.6%和20.2%。

图5 磷对铝胁迫紫花苜蓿PSII 和PSI 快速光曲线的影响Fig.5 Effect of phosphorus on ETRII and ETRI of alfalfa under aluminum stress

与对照相比，铝胁迫明显抑制了苜蓿光系统Ⅱ（PSII）的光能利用效率（α）和潜在最大相对电子传递效 率（rETRmax）（表3），而添加磷对铝胁迫苜蓿rETRmax值有明显的提升作用，同时增加了铝胁迫苜蓿PSII 的半饱和光强（Ik），提高了铝胁迫苜蓿PSII 对强光的耐受程度和最大相对电子传递效率。铝胁迫明显抑制了光系统I 的rETRmax和Ik，磷添加对铝胁迫苜蓿光系统I 的Ik 有一定的修复作用。

表3 紫花苜蓿光系统Ⅱ和光系统Ⅰ快速光曲线拟合参数Table 3 Fitting parameter of fast light curve of photosystem Ⅱand I in Al-stressed alfalfa

2.8 磷对铝胁迫紫花苜蓿根系有机酸分泌和体内有机酸含量的影响

对根系草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的分泌量进行测定，结果表明，铝胁迫紫花苜蓿根系的草酸和柠檬酸分泌量在短时间（3 h）内显著增加，但未检测出苹果酸和琥珀酸（表4）。磷添加明显降低了铝胁迫苜蓿根系草酸和柠檬酸的分泌量，依次比铝处理降低了27.27% 和16.00%（3 h）、27.20% 和13.14%（6 h）、20.47%和9.48%（12 h）、28.23%和12.59%（24 h）。

表4 磷对铝胁迫紫花苜蓿根系有机酸分泌量的影响Table 4 Effect of P on organic acid secretion of alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

铝胁迫明显降低了苜蓿根系的草酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸含量，而磷添加明显提高了铝胁迫苜蓿根系的草酸和苹果酸含量（表5）。磷添加处理的根系草酸和苹果酸含量分别比铝处理增加了19.63%和42.72%（3 d）、7.29%和5.13%（7 d）、22.73%和284.00%（10 d）。磷对铝胁迫苜蓿根系琥珀酸和柠檬酸含量的促进作用不显著。

表5 磷对铝胁迫下紫花苜蓿根系有机酸含量的影响Table 5 Effect of P on organic acid content in alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

3 讨论

铝毒是抑制酸性土壤植物生长的主要因素，铝敏感植物对铝胁迫的最初响应是根系伸长生长受到抑制，进而影响植物对营养和水分的吸收利用。磷是植物生长必需的大量元素，添加200 μmol·L-1磷可明显促进铝胁迫紫花苜蓿幼苗的根长和根系活力，表明磷具有缓解苜蓿铝毒害的功能。非生物胁迫下，植物细胞会受到伤害，质膜透性增大，电解质外渗致使电导率升高［21］。本研究中，铝胁迫导致叶片电导率显著上升，苜蓿细胞受到铝毒伤害，而添加磷后叶片的相对电导率明显低于铝处理，表明磷可以有效缓解铝胁迫对苜蓿叶片质膜造成的伤害，这与王保明等［22］的研究结果一致。MDA 是积累膜脂过氧化的产物，其含量可以反映植物细胞膜的损伤程度，同时细胞内过多MDA 积累会进一步毒害生物体［23-24］。本研究发现铝胁迫使得苜蓿叶片MDA 含量增加，而添加磷后，MDA 含量显著下降，说明磷能够减轻铝毒造成的细胞膜脂过氧化程度，保护生物膜的结构和功能。在油茶、玉米（Zea mays）、水稻等植物的研究中也发现，磷对铝胁迫造成的植物生理伤害有明显的缓解作用［25］。

叶绿素是植物光合作用的重要物质，承担光能的捕获、吸收和分配功能，影响植物的光合作用。本研究中，铝胁迫紫花苜蓿叶绿素a 和叶绿素b 的含量下降，原因之一是Al3+与Mg2+竞争质膜的结合位点，影响植物对Mg2+的吸收和转运，从而抑制了叶绿素的合成［26］。本研究发现，叶绿素a 比叶绿素b 对铝更加敏感，这与肖祥希等［27］的研究结果一致。添加磷后，铝胁迫紫花苜蓿叶绿素a 和叶绿素b 含量明显提升，表明磷能够缓解铝胁迫对叶绿素a的伤害。气孔和非气孔限制都会影响植物的光合速率，气孔限制是由气孔导度下降导致的胞间CO2浓度降低，使暗反应速率下降［28］；非气孔限制主要由于净光合速率下降所引起的胞间CO2积累，叶肉细胞对CO2的固定能力减弱，最终引起光合速率下降。本研究中，铝胁迫导致紫花苜蓿蒸腾速率和光合速率下降，原因是铝胁迫引起紫花苜蓿气孔导度下降，从而降低了叶片的蒸腾作用；而胞间CO2浓度上升说明光合速率的降低并非气孔导度下降导致CO2不足所引起，而是由于植物光合系统破坏，导致对CO2的同化能力下降所引起。添加磷后，铝胁迫苜蓿叶片的胞间CO2浓度下降，光合速率显著增加，表明磷降低了铝对苜蓿叶肉细胞的伤害，增加了叶肉细胞对CO2的溶解能力，从而提高了光合速率。此外，磷添加对铝毒导致的PSII 活性下降具有明显的修复作用，提高了铝胁迫苜蓿PSII 对强光的耐受程度和最大相对电子传递效率，从而促进了铝胁迫苜蓿的光化学效率、ETRII 和ETRI 的相对电子传导速率。ETRI 的升高能够有效降低铝毒引起苜蓿叶肉细胞类囊体的电子积累数量，以及由此引起的类囊体活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加，从而保护叶绿体结构，提高光能转化为化学能的效率。

铝胁迫下，许多植物根系分泌有机酸，并与铝形成螯合物以减轻铝毒，同时能够加速土壤中磷的溶解，增加磷的有效性，铝诱导苜蓿分泌的有机酸主要包括草酸、苹果酸、柠檬酸等，其中草酸活化土壤磷的功能最强，其次是柠檬酸、苹果酸。本研究发现铝胁迫下紫花苜蓿根系草酸和柠檬酸的分泌量明显增加，而且响应十分迅速，在3～6 h，说明促进有机酸分泌是紫花苜蓿适应铝胁迫的重要机制，一方面，螯合根际周围活性铝，降低铝的活性和根系对铝的吸收，另一方面，活化根际磷，促进根系对磷的吸收，平衡体内磷的内稳态。许多研究表明铝胁迫能够诱导植物有机酸合成酶的活性和基因表达增强，诱导根系大量分泌柠檬酸［29］。但也有研究表明植物分泌有机酸与有机酸合成酶活性无关，Yu 等［30］研究表明，铝处理下豇豆（Vigna unguiculata）CS、苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性均未增加，但豇豆根系仍分泌大量有机酸，抵抗铝毒害。本研究发现铝胁迫下紫花苜蓿在分泌草酸和柠檬酸的同时，根系的有机酸含量有所减少，表明铝胁迫下苜蓿根系有机酸的合成并未增加。同时，本研究发现在磷的作用下，铝胁迫紫花苜蓿有机酸的分泌量明显减少，但根系草酸和苹果酸含量明显增加，说明磷促进苜蓿耐铝毒能力与草酸和苹果酸合成有关，而不是通过诱导植物分泌有机酸来缓解铝毒。一方面，草酸和柠檬酸可以在细胞内与铝形成对植物细胞无害的络合物，从而阻止铝与细胞成分结合，降低铝毒害。另一方面柠檬酸、苹果酸参与三羧酸循环和乙醛酸循环，从而影响植物呼吸作用和光合作用。铝胁迫下由于有机酸（柠檬酸、苹果酸）含量显著降低影响苜蓿光合代谢，而施加磷后柠檬酸、苹果酸含量增加，光合系统的损伤程度降低，从而缓解了铝毒对紫花苜蓿生长的影响。

4 结论

磷处理明显缓解了铝对紫花苜蓿幼苗的毒害作用，光合能力、光化学效率和电子传递速率明显增强，生长速率明显增加。添加磷引起铝胁迫苜蓿根系草酸和苹果酸含量增加是磷缓解苜蓿铝毒害的主要原因之一。本研究结果揭示了磷和铝共同作用下，紫花苜蓿生长和光合生理之间的相关关系，磷通过提高根系有机酸含量，特别是草酸、柠檬酸含量改善铝胁迫苜蓿光合生理，从而缓解苜蓿铝毒害，为进一步研究紫花苜蓿抗铝毒的生理和分子机理提供了依据。