穆杨，罗凌波，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

睾丸支持细胞为精子细胞提供结构支持，参与构成血睾屏障和生精微环境，并发挥旁分泌作用，在精子的免疫豁免以及成熟中发挥重要作用。肥胖会破坏血睾屏障，损害睾丸支持细胞功能，进而损害男性的生育力[1-5]；睾丸局部游离脂肪酸水平过高，会刺激睾丸支持细胞产生过多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，这些不稳定基团攻击生物膜结构和细胞DNA，会导致细胞发生凋亡。研究发现，肥胖患者睾酮水平显著下降[6-7]，使用睾酮替代疗法可增加人体的血清睾酮水平[8]，并抑制生精细胞的凋亡[9]；睾酮可抑制睾丸支持细胞的氧化损伤[10]。然而，睾酮对肥胖导致的睾丸支持细胞受损是否具有保护作用，目前仍未见相关研究报道。本研究以棕榈酸(palmitic acid，PA)体外刺激模拟体内的高脂环境处理小鼠睾丸支持细胞系(TM4)建立体外细胞损伤模型，评价睾酮对支持细胞的保护性作用。

材料与方法

一、主要实验材料及试剂

TM4小鼠睾丸支持细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。睾酮购自爱必信(上海)生物科技有限公司(货号abs816670)；DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；CCK8检测试剂盒购于日本同仁化学；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司；抗Occludin兔单克隆抗体购自英国Abcam。其余所有实验试剂的纯度均为国产分析纯。

二、实验方法

1.TM4细胞培养：将TM4细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的条件下培养，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

2.细胞分组处理：将上述TM4细胞分为3组，分别为对照组、PA模型组(PA组)、PA模型睾酮干预组(睾酮+PA组)。PA组仅采用PA干预，PA模型睾酮干预组为PA及睾酮共同干预。PA干预浓度为1 mmol/L[11]，睾酮干预浓度为2 μg/ml[10]。PA和睾酮均采用0.1% DMSO配制。对照组加入等量等浓度的DMSO作为对照。

3.细胞存活率检测：将TM4细胞种在96孔板上，按照上述实验分组处理24 h后，使用CCK8试剂盒检测TM4细胞存活率，实验操作步骤按照试剂盒说明书进行。以对照组细胞存活率作为100%，计算各组细胞相对存活率。实验重复6次，每次实验设置5个复孔。

4.RT-PCR检测：用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的TM4细胞，制成5×104/ml的细胞悬液；将TM4细胞接种在6孔板上，DMEM培养基培养48 h后，去除培养基，PBS清洗3次，将细胞分为3组：对照组、PA组、睾酮+PA组，PA干预浓度为1 mmol/L，睾酮干预浓度为2 μg/ml，处理24 h后加入Trizol(Takara，日本)用于提取细胞总RNA，用反转录试剂盒在20 μl RNA反转录体系中反转录得到cDNA。使用cDNA样本配制实时定量PCR反应体系，使用实时定量PCR仪检测Occludin、ZO-1以及核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)、CAT和NAD(P)H脱氢酶(NAD(P)H dehydrogenase quinone 1，NQO1)的mRNA表达水平。引物由上海生工合成，引物序列见表1。以GAPDH为内参，利用2-ΔΔCt方法分析mRNA相对表达。

表1 RT-PCR引物

5.Western-blot检测：取不同处理方案干预24 h的TM4细胞用PBS清洗3次并加入RIPA细胞裂解液，4℃超声裂解，离心30 min，离心后吸取上清液并采用BCA法测定蛋白浓度。使用SDS-PAGE检测蛋白表达，在转膜封闭后使用Occludin单克隆抗体(稀释比1∶1 000)和GAPDH单克隆抗体(1∶10 000，Abcam，英国)4℃孵育过夜，次日TBS清洗，二抗常温孵育2 h，TBS清洗后显色。利用凝胶自动分析成像系统(ECL，Bio-Rad，美国)对蛋白条带进行采集和灰度值分析，GAPDH作为内参，计算目标蛋白的相对表达量，进行统计分析。

6.SOD和CAT活性及GSH含量的检测：将TM4细胞按照前述干预培养24 h后，使用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，4 000 r/min离心5 min，收集细胞超声裂解后，4℃、1 200g离心5 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定SOD和CAT活性，同时测定GSH含量。

三、统计学方法

采用SPSS22.0进行统计分析。所有数据均以(均数±标准差)表述，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、TM4细胞存活率的改变

PA组TM4细胞存活率较对照组显著降低[(52.1±3.3)% vs.(100.0±11.9)%，P<0.05]，而睾酮干预之后(睾酮+PA组)细胞存活率较PA组显著升高[(82.9±6.4)% vs.(52.1±3.3)%，P<0.05](图1)。

以对照组细胞存活率为100%的各组细胞相对存活率；与对照组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05图1 不同处理组TM4细胞存活率的改变(n=6)

二、血睾屏障的主要连接分子Occludin和ZO-1的表达改变

与对照组相比，PA处理后TM4细胞中Occludin和ZO-1的mRNA表达水平显著下降(P<0.05)；与PA组相比，睾酮干预后(睾酮+PA组)Occludin和ZO-1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)(图2)。

A：Occludin；B：ZO-1；与对照组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05图2 不同处理组TM4细胞中血睾屏障主要连接因子的mRNA表达(n=6)

随后，我们进一步检测了Occludin的蛋白表达水平。结果显示，PA刺激可显著降低Occludin的蛋白表达水平(P<0.05)；与PA组相比，睾酮处理后(睾酮+PA组)Occludin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图3)。

与对照组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05图3 不同处理组TM4细胞中Occludin 蛋白表达(n=6)

三、SOD和CAT活性以及GSH含量的改变

与对照组相比，PA处理后TM4细胞SOD和CAT活性显著降低，GSH含量显著降低(P<0.05)；与PA组相比，睾酮干预之后(睾酮+PA组)SOD和CAT活性显著升高，GSH含量显著升高(P<0.05)(图4)。

A：SOD活性；B：CAT活性；C：GSH含量；与对照组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05图4 不同处理组TM4细胞中SOD和CAT活性以及GSH含量(n=6)

四、抗氧化基因的改变

与对照组相比，PA处理后TM4细胞内Nrf2、HO-1、CAT和NQO1的mRNA水平下调(P<0.05)；与PA组相比，睾酮干预之后(睾酮+PA组)上述指标的mRNA水平均有所升高(P<0.05)(图5)。

与对照组比较，*P<0.05；与#PA组比较，P<0.05图5 不同处理组TM4细胞中抗氧化基因的mRNA表达水平(n=6)

讨 论

本实验采用PA处理TM4细胞模拟肥胖导致的生殖细胞脂毒性，发现PA处理后TM4支持细胞的存活率显著下降，血睾屏障蛋白Occludin和ZO-1表达下调。以此为体外细胞损伤的模型，发现睾酮干预可增加细胞存活率和屏障蛋白Occludin和ZO-1的表达。此外，睾酮可增加TM4细胞的抗氧化基因的表达，上调抗氧化酶的活性。因此，睾酮对睾丸支持细胞具有保护性作用。

氧化应激在肥胖导致的男性生精功能受损中发挥了重要作用[2，12-14]。我们前期研究也表明，氧化应激致细胞凋亡、自噬激活、内质网应激是肥胖性生精功能受损的重要机制[11，15-16]。氧化应激的过度激活不仅会对精子细胞产生直接损害，还可通过影响睾丸间质细胞和支持细胞的功能，间接地影响精子发生[17-18]。本研究中，PA处理TM4细胞建立细胞损伤模型，抗氧化酶SOD和CAT的活性下调，GSH含量降低，提示TM4遭受氧化损伤，细胞内氧化还原体系被破坏。Nrf2信号通路是最重要的抗氧化转录调节因子之一。当细胞遭受刺激时，Nrf2由细胞质转录到核内，转录合成下游抗氧化因子HO-1和NQO1等发挥抗氧化作用；PA处理后，TM4细胞内Nrf2、HO-1、NQO1表达均下调，提示Nrf2通路的受损可能是肥胖小鼠TM4细胞功能障碍的机制之一。

研究发现，睾酮可以抑制体内的多种促炎症因子的产生[19-21]，减轻C2C12骨骼肌细胞的凋亡[22]；睾酮治疗可有效提高肥胖糖尿病小鼠胰岛素的反应性[23]。睾酮可以有效激活衰老肝脏中的Nrf2信号通路，抑制衰老相关的氧化损伤[24]。虽然睾酮可以通过多种途径发挥保护作用，但是其对肥胖导致的睾丸支持细胞功能受损的具体作用，目前仍未见相关研究报道。本研究发现，PA损伤模型经睾酮干预之后，TM4细胞存活率增加，血睾屏障的主要连接分子Occludin和ZO-1表达上调。同时，抗氧化酶活性增加，Nrf2等基因表达上调。这提示，睾酮保护支持细胞免于PA损伤可能是通过增强其抗氧化的作用。

本研究尚有不足：仅针对睾丸支持细胞组成血睾屏障的功能进行了研究，对抑制素B和雄激素受体的表达未进行检测，睾酮在此方面的作用仍需进一步实验研究加以证实。本研究结论目前仅建立在细胞模型的体外实验基础之上，尚需要进一步的动物在体实验进行验证，从而为可能的临床应用提供依据。

综上所述，实验条件下外源性睾酮可提高体外培养支持细胞的抗氧化酶活性，改善PA诱导的细胞功能损伤，起到细胞保护的作用。我们的研究为肥胖性男性不育的治疗提供了新的思路。