沙中玮 肖姝雲 钱春美 李 欧 张 洁 高圆媛 徐 建

(上海中医药大学附属市中医医院1 神志病科，2 实验中心，上海市 200071，电子邮箱：shazhongwei1989@163.com)

压力应激是抑郁症、焦虑症发生发展的影响因素[1-2]，研究人员一直致力于建立一种高效度的模拟人类情绪应激状态的动物模型，发现长期暴露于压力环境下的啮齿动物会出现焦虑、抑郁样行为；慢性温和不可预知应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型是一种应用广泛、有效且可靠的复合应激模型[3-4]，能够诱导啮齿动物产生焦虑、抑郁样行为[5]。本研究通过CUMS诱导大鼠产生心理社会应激反应，观察大鼠体质量、行为学、外周血清促炎症细胞因子及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)水平的变化，为进一步实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级Wistar雄性大鼠12只，体质量均为200 g左右，购于上海斯莱克实验动物有限公司[动物生产许可：SCXK(沪)2017-0005，动物质量合格证编号：2015000562560]，饲养于上海中医药大学附属市中医医院动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014-0019]，每笼4只，饲养环境：室温(23±2)℃，湿度80%，12L/12D光照节律，适应性喂养7 d，其间自由饮水摄食。

1.1.2 主要试剂和仪器：大鼠旷场实验箱(安徽正华生物仪器设备有限公司，尺寸：50 cm×50 cm×50 cm，型号：ZH-PS)；ZH-ZFT型自发活动实验视频分析系统(上海彤兴生物科技有限公司)；大鼠高架十字迷宫视频分析系统(成都泰盟软件有限公司，型号：PMT-100；高架十字迷宫尺寸：各臂臂长425 mm，宽度100 mm，高架高度500 mm，开臂臂高10 mm，闭臂臂高225 mm)；超纯水机(HealForce公司，型号：NWVF-10)；洗板机(Labsystems Dragon公司，型号：4MK2)；微孔板孵化器(Bio-Rad公司，型号：237)；酶标仪(Labsystems Dragon公司，型号：MK3 353)；酶标系统(上海百基生物科技有限公司，型号：Varioscan Flash)；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、BDNF酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(武汉博士德公司，批号：240141101108、133141051108、3714921108)。

1.2 实验分组及CUMS模型的建立[1]将12只大鼠按随机数字表法随机分为空白组和模型组，各6只。适应性喂养7 d后，测量每只大鼠体质量。空白组不给予任何处理，模型组进行为期28 d的CUMS刺激：给予禁水、禁食、潮湿垫料、笼倾斜45°、混笼、光周期变化、强迫游泳(水温23.2℃)5 min等7种不可确定性轻度刺激，1次/d，按造模刺激时间表进行刺激，并于第28天CUMS刺激结束后，行为学实验开始前测量每只大鼠体质量。

1.3 行为学实验

1.3.1 旷场实验：于造模前、造模第14天和造模第28天后分别对每只大鼠进行旷场实验。研究者持大鼠尾根1/3处将其轻轻放入旷场实验箱底中央(底色为黑色)，立即盖上嵌有摄像头的实验箱盖子(底色为黑色)，摄像系统及ZH-ZFT型实验视频分析系统自动同步记录大鼠5 min内的行为变化，研究者根据监测结果记录大鼠总路程、中央活动路程和平均速度，每只大鼠测试1次。每只大鼠测试完毕，研究者用20%酒精擦拭箱底，再用干纱布擦净。

1.3.2 高架十字迷宫实验：造模第28天旷场实验结束后，同日进行高架十字迷宫实验。测试前，将大鼠提前5 min单独放置在一个白色塑料箱(60 cm×60 cm×35 cm)中适应新环境5 min，随后将大鼠轻轻放置于高架十字迷宫的中央，使其头部朝向开臂区，释放大鼠后通过摄像系统及PMT-100十字迷宫视频分析软件同步记录大鼠5 min内的开放臂区进入次数、开臂区滞留时间、闭臂区进入次数、闭臂区滞留时间、中央区进入次数、中央区滞留时间等相关参数，总时间=开臂区滞留时间+闭臂区滞留时间+中央区滞留时间，总次数=开臂区进入次数+闭臂区进入次数。计算焦虑指数[6-7]。焦虑指数值在0～1范围内，焦虑指数越高表示类似焦虑的行为越频繁。

1.4 ELISA法检测大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平 在造模第28天行为学实验结束后，立即将大鼠麻醉后抽取腹主动脉血3～5 mL，室温凝固2 h或4℃过夜，3 000 r/min离心10 min，收集血清置于-80℃冷藏待测。采用ELISA试剂盒分别检测血清TNF-α、IL-6、BDNF水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料以[M(P25，P75)]表示，比较采用秩和检验。重复测量计量资料的比较采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组大鼠造模前后体质量的比较 造模前两组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模第28天后，模型组大鼠体质量轻于空白组(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠造模前后体质量的比较(x±s，g)

2.2 两组大鼠旷场实验结果的比较 经球形检验，两组旷场实验总路程数据符合球形假设(P=0.083)。主体间效应方差分析检验显示，两组大鼠总路程比较，差异无统计学意义(F组间=0.928，P组间=0.358)，两组总路程均有随时间的延长而下降的趋势(F时间=35.237，P时间<0.001)，分组与时间不存在交互效应(F交互=2.098，P交互=0.149)。见表2。

经球形检验，两组旷场实验中央活动路程数据符合球形性假设(P=0.295)。主体内效应检验显示，两组大鼠中央活动路程比较，差异无统计学意义(F组间=1.913，P组间=0.197)，两组中央路程均有随时间变化的趋势(F时间=4.014，P时间=0.034)，其中，两组中央活动路程从造模开始至造模第14天呈现上升的趋势，造模第14天开始至造模第28天呈现明显下降趋势。分组与时间不存在交互作用(F交互=1.359，P交互=0.280)。但造模第28天，模型组中央活动路程短于空白组(P<0.05)。见表2。

经球形检验，两组旷场实验平均速度数据满足球形性假设(P=0.083)。主体间效应检验显示，两组大鼠平均速度比较，差异无统计学意义(F组间=0.933，P组间=0.357)，两组平均速度均有随着时间的延长而下降的趋势(F时间=35.232，P时间<0.001)，分组与时间不存在交互效应(F交互=2.099，P交互=0.149)。见表2。

表2 两组大鼠旷场实验总路程结果比较(x±s)

2.3 两组大鼠高架十字迷宫实验结果的比较 模型组大鼠的开臂区滞留时间短于空白组(P<0.05)，而两组大鼠开臂区运动距离、开臂区进入次数、开臂/在臂进入次数百分比、开臂/在臂滞留时间百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。两组大鼠的闭臂区滞留时间、闭臂区运动距离、闭臂区进入次数、闭臂/在臂进入次数百分比、闭臂/在臂滞留时间百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。两组大鼠的中央区滞留时间、中央区运动距离、中央区进入次数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。造模第28天，模型组、空白组的焦虑指数分别为(0.87±0.05)%、(0.78±0.07)%，模型组焦虑指数高于空白组(t=-2.563，P=0.028)。

表3 两组大鼠高架十字迷宫开臂区行为学的比较

表4 两组大鼠高架十字迷宫闭臂区行为学的比较

表5 两组大鼠高架十字迷宫中央区行为学的比较(x±s)

2.4 两组大鼠外周血清TNF-α、IL-6、BDNF水平的比较 两组大鼠血清TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠血清IL-6水平高于空白组，但BDNF水平低于空白组(P<0.05)。见表6。

表6 两组大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平的比较(x±s，pg/mL)

3 讨 论

随着我国经济社会的快速转型、生活节奏的加快，每个人都顶着多重身份和角色，压力或应激充斥着每个人的生活和工作，心理健康问题日益凸显，其已成为备受关注的精神心理公共卫生问题。长期暴露在情绪应激的压力环境下，人们的行为会产生病理性改变。本研究通过构建CUMS大鼠模型模拟人类的情绪应激反应，观察CUMS对大鼠行为学、外周血清促炎症因子及BDNF水平的影响。

旷场实验通常被用于测定啮齿动物的运动功能和情绪[8]，具有操作简单、可行性良好等特点，能够通过记录总活动路程、中央活动路程等指标评价大鼠的不同行为变化。旷场实验中央区活动反映了啮齿动物对新奇环境的探索行为[9]。但研究显示，疲劳或抑郁的大鼠自主运动能力下降，更喜欢在箱子的边缘区域活动，且其总活动路程会减少[10]。本研究结果显示，造模第28天，模型组中央活动路程短于空白组(P<0.05)，而造模前、造模第14天、造模第28天两组大鼠的总路程和平均速度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示造模第28天大鼠在旷场实验中存在一定的探索矛盾心理，造模前和造模14 d时焦虑水平不明显。

高架十字迷宫通过记录啮齿动物在开臂区和闭臂区的滞留时间、进入次数来评价焦虑样行为，被广泛应用于啮齿动物焦虑行为的评估，并常用于抗焦虑药物的筛选[11]。开臂区相关行为学指标反映焦虑行为的变化，本研究结果显示，模型组大鼠的开臂区滞留时间短于空白组(P<0.05)，而两组大鼠开臂区运动距离、开臂区进入次数、开臂/在臂进入次数百分比、开臂/在臂滞留时间百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示CUMS大鼠趋于避开开臂区，表现出一定的焦虑样行为。闭臂区相关行为学指标主要反映自主活动变化中央区域是开臂与闭臂的交叉区域，主要用于测试开始时动物选择活动区域以及计算总时间，本研究结果显示，造模第28天两组大鼠的闭臂区滞留时间、闭臂区运动距离、闭臂区进入次数、闭臂/在臂进入次数百分比和闭臂/在臂滞留时间百分比以及中央区滞留时间、中央区进入次数、中央区运动距离比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，与空白组比较，造模第28天模型组大鼠的体质量降低，焦虑指数升高(P<0.05)，提示持续28 d的CUMS能够使大鼠体质量下降，诱导大鼠产生焦虑样行为。

研究证明，慢性应激能够下调BDNF的表达[12]，促进炎症反应[13]。本研究结果显示，模型组大鼠血清IL-6水平高于空白组，BDNF水平低于空白组(均P<0.05)，但两组大鼠的TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示CUMS可以诱导大鼠外周血清BDNF水平降低，促进促炎症细胞因子IL-6的释放。这与既往研究结果相似[14-16]。说明CUMS诱导焦虑样行为的发生机制可能与促炎症因子的释放、BDNF的减少有关。

综上所述，CUMS能够诱导大鼠产生焦虑样行为，使大鼠体质量下降，促进IL-6释放，降低血清中BDNF水平。虽然焦虑的确切机制尚不清楚，但可能与促炎症细胞因子介导的炎症反应、BDNF的减少导致疾病条件下神经元受损有关[17]。