黄锦程

【摘要】凝血因子Ⅷ是治疗血友病的常见类型，具有良好的耐药性、安全性和疗效。由于凝血因子Ⅷ的半衰期相对较短，通常需要大剂量预防和治疗出血，以及频繁输血，本文综述了延长凝血因子Ⅷ半衰期的研究进展和最重要的技术方法。人凝血因子是人血浆中一种重要的蛋白，用于降低出血的风险。是人体凝血的激活途径的重要蛋白组分之一。低凝血因子Ⅷ水平可导致不同程度的凝血障碍。目前，血浆冷沉淀在我国主要用作血浆凝血因子Ⅷ储存的原料，也可以用离子交换法进行净化。采用血浆收集、熔化、离心冷却。研究了离子交换层析、病毒灭活和冷冻干燥，主要针对这些方面展开研究。

【关键词】人类;凝血因子Ⅷ;研究;进展

【中图分类号】R973   【文献标识码】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.209

前言

凝集素是人體血浆中最重要的蛋白质之一，也是静脉血液循环的重要组成部分。目前，血液中凝血因子Ⅷ水平较低是甲型血友病的指标，根据世卫组织预防血友病的数据可能会有不同的水平，它是凝血因子Ⅷ编码基因突变导致该凝血因子功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病全世界每10000人中有1人发病。随着检测手段的普及，更多的患者被发现，数据显示，尽管凝血因子Ⅷ供应量有所上升，但国内仍存在供不应求的问题。中国一直在进口凝血因子Ⅷ很多年了。造成我国凝血因子短缺的主要原因是生产技术，比如上海生物制品研究所有限公司的FVIII产品就可以生产。考虑到国家政策的影响，有必要开发一条新的血浆生产线。在开发的同时生产研制凝血因子Ⅷ， 应加快产品的市场推广，对冷藏和溶出的制备进行了研究。

1  FⅧ的结构与性质

1.1结构

FⅧ主要由肝细胞组成。前体含有2351个氨基酸，这些氨基酸从内网中去除，形成硫键和N-糖基化。一个B场和两个C场在A1、A2和A3之后有较短的酸性区，而f场在A1、A2和A3之后有较短的酸性区Ⅷ序列域是一个高水平的N-糖基化区，与F无关Ⅷ 活动，但只能通过身体的加工和分泌;在A2和A3地区，硫化酪蛋白被用作FⅧ的附加因子。大多数FⅧ在b-a3或b区被分成两条独立的链，轻链由a3-c1-c2组成;重链由a1-a2和B区组成。B区的长度随B区的长度而变化。同时，一些金属离子（如Ca′或Mn）可以通过改变蛋白质含量进行配位，FVI与vwF-a3（和C2）结合的关键在于，FVI与vWF的结合覆盖了FVI、vWF-FⅧ和磷酸盐的接触点，以防止F的去除Ⅷ 磷脂，防止x-酶复合物的形成，保护fⅧ 从激活FXa和活性蛋白C，延长体内半衰期。

1.2活化与失活

FⅧ被激活为FⅧ通过己糖或FXa。凝集酶与重链中的a1-a2和a2-b结合，与轻链N端的Arg 1689结合，在这些区域，切断FVI的作用。FXa与血栓形成的机制相同，但也有不同于血栓形成的迹象。FXa与C2的相互作用可能影响重链的分裂，而C2不影响血小板酶的分裂;活化后，FⅧ和vWF重组形成三个组合;活化后，FⅧ与磷脂固定剂和Ca2+相互作用形成酶因子X，两组疏水基团被用于磷酸双层膜，当一系列a-残基相互作用形成盐桥时，FⅧ a大大提高了FX的催化效率。FⅧA和FX由盐桥通过静电有源f来控制Ⅷ A是非常不稳定的，A2区域可以很容易地从这三种组合中分离出来。一些新的重组FⅧ提高了稳定性，一种防止A2解离的方法是在f的半衰期内保留一个小片段Ⅷ 在轻链A3中，硫酸和A2之间的共价键可以通过基因突变而增加另一种可能的生命损失是活化蛋白A的水解。APC将A2分为arg562，将A1分为arg336。然而，arg336的分裂改变了A1和A2之间的相互作用，导致因子活性的丧失和高血栓含量Ⅷ 保持凝血和抗凝剂的平衡。

2  FVIII的制备

2.1概述

1965年美国开发了一种在封闭无菌系统中从单个血浆生产冷沉淀制剂的方法。但是，冷沉淀制剂的比活性尚不确定，其纯度低，含有血型微粒和抗体，可引起过敏反应。70年代以后，发展了以冷沉淀为原料制备分离纯化的方法，90年代用单克隆抗体亲和层析技术制备了两种高纯度的FⅧ制剂。单抗亲和层析法具有收率高、成本低等优点。FⅧ制剂的纯度不断提高，生产过程中进行严格的病毒活化处理，目前在临床上广泛应用。所有产品均来自人血浆，主要使用离子交换色谱法从人血浆冷冻沉淀液中分离纯化。

2.2离子交换色谱法

以往的沉淀法如聚乙二醇沉淀法和甘氨酸沉淀法生产的FⅧ纯度较低。纤维蛋白原（FG）、纤维连接蛋白（FN）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）含量较高，FⅧ含量不到总蛋白的1%。先驱采用凝胶色谱法生产高纯度FⅧ制剂，冷冻沉淀液溶解后用氢氧化铝吸附去除维生素K依赖性凝血因子，残渣吸附在柱上。由于其大孔径和弱疏水性，树脂对FⅧ有很强的结合力。该方法可使传统FⅧ制剂的纯度提高200倍，产品稳定性高。国内几家厂商经常采用这种生产工艺或在此基础上进行优化和进一步改进。

2.3基因工程法

重组凝血因子FⅧ是第一个利用DNA人工重组技术生产和销售的重组凝血因子。类似天然FⅧ的生化特性已成为许多发达国家最重要的药物。FVIII位于X染色体长臂的末端，重组长度FⅧ代表机体的重组，它是将整个人类DNA序列的表达包含在向量机中产生的。以微粒子为表达载体，对克隆进行了高度检测。在没有血清培养的情况下，加入牛胰岛素、人蛋白和蛋白酶抑制剂。细胞分批培养，经亲和层压和二级离子交换纯化。由于FⅧ的结构域不影响其活性，而结构域B的缺失导致其表达量增加了20倍，因此FⅧ该结构域中缺失的产物被开发出来。培养基中还含有人血清蛋白和重组胰岛素500升培养液。培养是一种连续注射法。当细胞密度达到上限时，温度转化为溶解氧，油酸酯进入生产阶段，残渣不断积累。残渣经S/D破坏后，通过各种色谱程序进行纯化，然后冷冻干燥得到。

3  过程

3.1血浆采集保存

生物血浆是一种通过一次提取获得的健康人体血浆，用于生产血浆蛋白原代血浆是血浆蛋白公司的生命线低温储存在血浆采集过程中影响原血浆中FⅧ的活性，影响FⅧ活性的因素很多，包括贮藏温度、pH值、血浆中无机盐离子、微球等蛋白质参与制造过程，影响FⅧ的稳定性。结果表明，柠檬酸盐含量对FⅧ的稳定性有影响，柠檬酸盐能与Ca2+血浆结合。Ca2+的减少导致了FⅧ层的不稳定性。冷冻原始血浆是一个非常重要的步骤。影响血浆冷冻的因素包括冷冻时间、冷冻速度、血浆收集容器的形状、体积和厚度。通过时间和温度的结合，不稳定成分如FⅧ的损失可以最小化。快速冷却或一次提取血浆可防止或减少血浆中FⅧ的丢失，血浆的缓慢冻结表明大部分FⅧ已丢失;冷冻血浆的最佳储存温度不高于-30，冷冻血浆的最佳储存温度为-2。血浆快速冷冻需要2小时，核温度不低于-20，对凝血活性有很大影响。血浆损耗因子很快，因此需要冷链加料系统来控制原血浆传输過程的质量。

3.2冷沉积

冷沉淀是以新鲜冰冻血浆经低温解冻制成的白色片状制剂，含有纤维蛋白、纤维化连接物、FX等;目前，国内血管中心水浴虹吸式熔融控制、CPC熔融离心、FFP室温凝固5分钟，然后用双袋软化管，将血浆溶解于水浴中，从血袋中取出60ml冰，离心，在冷沉淀中沉淀约25ml下层。熔点数字控制是指在室温下软化管后，FFP设定5分钟，但血浆在水浴中形成一定的滴高;多余的血浆堆积在空袋中，剩余的40-50毫升冷冻血浆堆积在冷血沉积物中。与虹吸法相比，离心法对FⅧ、纤维蛋白原和VWF的提取率较高。离心水浴用于控制初始温度和熔化时间。在解冻过程中，采用圆形槽进行解冻，以保证血浆包的温度均匀性。

4  半衰期延长的方法

4.1缓释

持续释放是为了延缓凝血因子Ⅷ的释放速率，并通过一定的处理降低药物进入血液的速率，以进一步提高蛋白质的生物利用度和稳定性。脂质体用于将蛋白质包裹在磷脂囊泡中，并将其与外部载体结合。重组FⅧ已被纳入长循环脂质体中。因子Ⅷ的半衰期可延长1.5～1.6倍。该方法的优点是可以长时间释放活性和未修饰的蛋白质。

4.2.化学改性

该方法的目的是通过化学改性延长F-Ⅷ的半衰期，防止和消除寿命损失。在这种方法中，与亲水性聚合物相关的特定蛋白质分子通常被聚乙二醇和有机硅修饰，也称为PEG修饰。聚乙二醇（PEG）是一种由环氧乙烷形成的可与蛋白质分子中活性物质基团结合的重复链。偶数连接后，与2-3个水分子结合;这不仅提高了蛋白质在水中的溶解度，而且增加了其分子量。肾脏根据物质的大小进行过滤，这样加入分子量的聚乙二醇后，蛋白质的脱落实际上会减慢;球形结构，作为保护肽，防止蛋白质分解;同时，针对不同的治疗方法可以优化蛋白质免疫、药代动力学和药代动力学，利用PEG与不同蛋白质间的共价化合物在临床研究中，聚乙二醇化可以显著延长半衰期和凝血效果。虽然这一成熟的技术已在原则上证明了蛋白质复合物的可行性，但仍存在一些局限性。PSA线性和均匀的聚苯乙烯是一种连接唾液的独特碳水化合物;它具有很高的亲水性、生物相容性和生物相容性。为了提高药物的稳定性和药理作用，药物的蛋白质或肽表面以化合物的形式与唾液相关值相连，根据报道，聚氨酯改性是防止蛋白质制剂降解的最佳方法，结果表明，SOD不仅能保持天然酶的高活性，而且能维持天然酶的高活性，而且在伦敦酸碱稳定性方面具有优于天然酶的优势，一个在格雷戈瑞大学的团队使用聚氨酯作为糖链的来源。结果表明：改性蛋白在血液中的半衰期明显延长，免疫原性和抗体降低，抗蛋白酶活性增强。干扰素的聚氨酯半衰期长。

4.3遗传突变

随着人类三级结构和结构领域的公布，随着基因工程的迅速发展，FⅧ得到了迅速的发展。基因工程的目标是减少蛋白质代谢。常用的技术包括转化或转化、基因和蛋白质去除。FⅧ通过限制脑酶的消化和活化而导致异源三聚体的不稳定性，A2亚类可迅速降解，从而限制其活性延长FⅧ半衰期的可能性之一是FⅧ在体外比野生FⅧ具有更强的活性和稳定性。FⅧ蛋白至少有三种LRP类型，分别位于A2、A3和C端。这些节点的突变会影响FⅧ与磷酸盐、固定液和vWF的相互作用，从而延长FⅧ的半衰期。

4.4蛋白融合

FⅧ融合蛋白技术越来越受到人们的重视，该技术利用重组DNA从FⅧ或N端合成载体蛋白。最常见的蛋白质载体是血清白蛋白和免疫球蛋白（IgG）Fc片段，人血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，其分子量为-67kDa。广泛分布于血管和血管外腔。它的半衰期长达19天，结构稳定，作为血液和药物中重要的物质载体，已成为药物设计的理想蛋白质载体，以提高半衰期，减缓药物的清除，增加药物的作用，白蛋白已被证明是蛋白质整合的载体，它能有效地延长各种蛋白质的半衰期，包括胰岛素、氨基酶等生物体的半衰期约为20天，其稳定性是由于IgG的Fc片段能与新的Fc受体结合，阻止IgG在溶酶体中的分解。用Fc片段IgG与活性蛋白结合形成整合素，增加活性蛋白在体内的半衰期，达到长期的目的。

5  结束语

既要重视药物的有效性和安全性，又要提高患者的生活质量。通过开发具有长半衰期的新蛋白质来治疗血友病。开发长期物理因子FⅧ具有很大的经济和社会优势，近年来的研究表明，一些方法取得了满意的效果，但也存在一定的局限性，如何降低疗效指标，减少免疫原材料，减少与其他蛋白质的相互作用。进一步的研究将为新技术的发展提供更多的机会。深入了解FⅧ的结构和功能，一方面有助于从基因水平了解血友病患者的特点，另一方面本文介绍了FⅧ高纯度产品的研制，为血友病A的诊断和治疗提供了更有效的方法。随着新技术的引进和各种色谱技术的应用，利用载体和色谱法，FVIII具有高纯度和高利用率，基因工程在世界范围内得到了广泛的应用，具有良好的应用前景和显著的经济效益。

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