王 乐，马丹丹，徐 盼，张 茜，崔 勇，叶放蕾

1)郑州大学第一附属医院耳科 郑州 450052 2)广东省医学科学院·广东省人民医院耳鼻咽喉科 广州 510080

诱导多能干细胞是体外通过一定条件将成体细胞重新编程到多能干细胞状态，具有胚胎干细胞相似的形态及增殖分化能力。人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[1]完全克服了胚胎干细胞在临床应用时涉及的伦理及免疫排斥问题，具有重要的临床应用价值，成为干细胞治疗的主要细胞来源。目前hiPSC已逐渐被应用到治疗中枢神经系统性疾病的研究[2-3]中，体外诱导hiPSC定向分化为神经干细胞的方法各不相同，效率低。本研究拟应用小分子化合物A8301和DMH1体外诱导hiPSC分化为神经干细胞，为进一步的细胞治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 细胞滋养层细胞系CF-1和hiPSC细胞来源于中国科学院广州生物医药与健康研究院。

1.2 主要试剂及仪器DMH1和A8301购自R&D公司，兔抗人Nestin多克隆抗体和鼠抗人Pax6多克隆抗体购自Santa Cruz公司，bFGF、Trizol试剂、DMEM/F12培养基、N2、B27、matrigel胶、血清替代物和2.5 g/L胰蛋白酶等购自Invitrogen公司，DMEM高糖培养基和GlutaMax等购自Gibco公司；紫外分光光度计和离心机为Eppendorf公司产品，光学显微镜和倒置荧光显微镜为Zeiss公司产品。

1.3 培养基与实验分组各个阶段应用的培养基及其组成成分见表1。细胞根据悬浮阶段所用培养基的不同分为实验组和对照组。悬浮阶段对照组用基础的无血清悬浮培养基培养；实验组用加入小分子化合物A8301和DMH1的无血清悬浮培养基培养。两组贴壁阶段均用维持神经分化的贴壁培养基。

表1 各阶段培养基组成成分

1.4 细胞培养

1.4.1HiPSC培养 实验前1 d 6孔板铺基质胶，30 min后每孔加入2×105个CF-1细胞及2 mL滋养层细胞培养基。吸弃hiPSC原有培养基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育，消化至克隆周边卷起；吸弃培养基，F12洗2遍；加入1 mL KSR，用1 mL枪头轻轻刮下hiPSC细胞团，平均分配到已经铺好滋养层细胞的6孔板中；每孔补加KSR到2 mL；摇匀，将6孔板缓慢转移至培养箱中。实验组和对照组各设6个复孔。

1.4.2悬浮培养与类胚体形成 吸弃hiPSC原有培养基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育3 min；吸弃培养基，F12洗2遍；添加适量F12，用1 mL枪头吹打细胞团，使其脱落；用无菌移液管转移细胞团至15 mL离心管，自然沉淀；弃上清，添加悬浮培养基2 mL，重悬；转移细胞克隆团至低黏附培养瓶中；于37 ℃细胞培养箱中过夜；次日更换培养瓶。

1.4.3贴壁培养 悬浮培养第9天，6孔板中每孔加入200 μL matrigel胶铺匀，铺设范围距离孔边0.5 cm，置37 ℃培养箱中30 min；吸弃matrigel胶；将悬浮状态下的类胚体移至15 mL离心管中，自然沉降；弃上清，贴壁培养基重悬类胚体；每孔均匀分配20～30个类胚体，滴加300 μL贴壁培养基，勿超出matrigel胶覆盖的范围；次日补加2 mL贴壁培养基。

1.5 qRT-PCR检测细胞中Pax6和Nestin mRNA的表达收集贴壁培养第12天时的各孔细胞，严格按照RNA抽提试剂盒说明提取总RNA。Pax6和Nestin引物见表2。PCR反应条件：预变性93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环，最后72 ℃ 1 min延伸。以actin为内参，采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

表2 引物序列

1.6 免疫荧光染色检测细胞Pax6及Nestin蛋白的表达吸弃培养基，PBS清洗，500 mL 40 g/L多聚甲醛固定5 min；500 mL PBS清洗5 min，吸弃，重复3遍；添加Pax6及Nestin一抗(均稀释1 000倍后使用)，孵育过夜；吸弃一抗，PBS洗3遍；添加二抗，常温孵育1 h，PBS洗3遍；加DPAI至完全覆盖细胞，常温孵育10 min，PBS洗3遍；加入1 mL PBS，锡箔纸避光包装，保存于4 ℃冰箱。应用荧光显微镜观察。

1.7 统计学处理应用SPSS 23.0分析。两组Pax6和Nestin mRNA表达的比较采用两独立样本t检验，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 HiPSC和类胚体的形态学观察在滋养层细胞上可以观察到未分化的hiPSC形成椭圆或圆形的细胞克隆团，边界清楚；克隆团内细胞核质比大，椭圆形或圆形(图1A)。悬浮培养第3 天，可见三维球形样细胞团即类胚体(图1B)。

2.2 神经花环的形成实验组类胚体进入贴壁培养阶段后，可进一步分化形成花环样结构，即神经花环(图1C)；而对照组神经花环形成较少(图1D)。

A：未分化阶段的hiPSC(×50)；B：悬浮阶段形成的类胚体(×50)；C：实验组贴壁阶段形成的神经花环(×100)；D：对照组贴壁阶段细胞形态(×100)

2.3 细胞中Pax6和Nestin表达情况实验组细胞Pax6和Nestin mRNA的相对表达量分别为(2.75±0.26)和(3.052±0.344)，均高于对照组的(0.97±0.18)和(1.018±0.131)(t=5.622和5.530，P<0.001)；免疫荧光染色结果见图2。

A：细胞核DAPI染色后呈蓝色荧光；B：Pax6染色后呈红色荧光；C：Nestin染色后呈绿色荧光；D：DAPI、Pax6和Nestin共染

3 讨论

HiPSC的产生解决了胚胎干细胞带来的伦理及免疫排斥问题，已被广泛应用到各种疾病如心肌病、神经系统疾病等的研究[4-6]中；其治疗神经系统疾病被认为是最具前景的方法[7-8]，但到目前为止，仍然未找到一种诱导hiPSC向神经细胞分化的高效方案。传统的关于干细胞诱导分化为神经干细胞的方法有以下几种。①视黄酸诱导：视黄酸是一种经典的神经诱导剂[9]，能促进胚胎干细胞定向分化为神经干细胞，但因视黄酸加入培养基后活性不稳定而使诱导效率低。②共培养法，可分为基质共培养和条件共培养，但共培养基成分复杂，不利于进行机制研究[10]。本研究采用无血清培养法，培养基由成分确定的生长因子及蛋白组成，不含成分不明的血清[11]，利于进行基础研究。

在体外悬浮培养时，多能干细胞形成三维球形样细胞聚集，这些聚集而成的细胞团叫作类胚体。类胚体有胚胎发育的所有标记，是干细胞分化的关键环节，调控类胚体的分化可有效控制干细胞的分化方向[12]。类胚体制作方法有悬滴法、应用低吸附培养板培养等[13]，这些方法操作复杂，成本较高。本研究首先使hiPSC在没有分裂能力的滋养层细胞上生长，形成细胞克隆团；其次通过悬浮培养使细胞克隆团形成类胚体；然后贴壁培养促使类胚体内细胞分化形成神经花环。神经花环由表达神经干细胞特异性标记的细胞构成，并能在一定条件下分化为各种神经细胞[14]。本研究观察到神经花环在培养12 d时形成的最多，这也与正常人类胚胎发育过程中神经管形成所需2周的时间一致[15]。

类胚体具有胚胎发育的所有标记，可分化成内胚层、中胚层及外胚层细胞，而在类胚体的形成过程中加入原条细胞抑制剂可以减少内胚层和中胚层细胞的形成。原条细胞的形成依赖于活化的BMP和TGF-β等信号通路[16]。很多研究[17]在形成类胚体阶段通过添加TGF-β和BMP信号通路抑制剂，抑制胚胎干细胞向中胚层和内胚层分化，同时应用碱性成纤维细胞生长因子促使神经干细胞增殖。但既往应用的抑制剂多为蛋白质,活性不稳定。小分子化合物作为高效稳定抑制剂，已被广泛应用到干细胞领域[18-19]；小分子化合物A8301可以选择性抑制TGF-βⅠ型受体激酶ALK5[19]；小分子化合物DMH1是BMP信号通路ALK2受体的选择性抑制剂[18]。Pax6和Nestin为神经元前体细胞的特征性标记。本研究联合应用小分子化合物A8301和DMH1抑制TGF-β和BMP信号通路，结果表明实验组Pax6和Nestin表达增高，提示A8301和DMH1可阻滞干细胞向内胚层及中胚层分化，从而更有利于hiPSC定向分化为神经干细胞。

综上，hiPSC可经过体外悬浮培养和贴壁培养形成富含神经干细胞的神经花环，同时小分子化合物A8301和DMH1可有效地促进hiPSC分化为神经干细胞。